BIAŁKA i KWASY NUKLEINOWE Uniwersytet Warszawski

Transkrypt

Zakład Biologii Molekularnej
BIAŁKA i
KWASY NUKLEINOWE
Materiały do zajęć dla studentów
w roku akademickim 2009/2010
Uniwersytet Warszawski
wersja 1.7
wersja elektroniczna dostępna na www.biol.uw.edu.pl/zbm/
Proszę wpisać w ramkę swoje imię i nazwisko
© Zakład Biologii Molekularnej UW, 2010 r.
Spis treści
Regulamin pracowni.........................................................3
Wstęp..................................................................................4
Literatura ogólna..............................................................6
Zespół prowadzący zajęcia..............................................6
Ćwiczenia
1. Oczyszczanie białek HMG z grasicy cielęcej...............................7
2. Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego białka SF2/ASF z
komórek bakterii Escherichia coli.............................................12
3. Elektroforeza natywna białek "BN PAGE".................................22
4. Oznaczanie aktywności ludzkiej topoizomerazy I w ekstraktach
jądrowych komórek HeLa..........................................................25
Appendix
1. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym zawierającym
SDS (SDS-PAGE)......................................................................27
2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym.....................................30
3. Po co są te substancje w roztworach stosowanych podczas
ćwiczeń?.....................................................................................32
Uwaga !!! W skrypcie zastosowano następujące oznaczenia:
1.
2.
Znakiem  oznaczono uwagi dotyczące czynności niebezpiecznych dla
zdrowia.
Podane w części opisującej wykonanie ćwiczenia numery odczynników (w
kwadratowych [ ] nawiasach) odpowiadają numerom stosowanym w spisie
odczynników.
2/ 33
Regulamin pracowni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
W pracowni należy zachować ostrożność, porządek i czystość.
W pracowni należy nosić bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy
pracy z substancjami szkodliwymi rękawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie
należy pozostawić w szatni wydziałowej.
Opuszczając stanowisko pracy należy sprawdzić czy wszystkie niepotrzebne
urządzenia elektryczne, gaz i woda zostały wyłączone, drobny sprzęt odłożony
na miejsce, a użyte naczynia laboratoryjne umyte i odłożone do suszenia.
Studenci nie mogą pracować w pracowni bez opieki pracownika
dydaktycznego.
W pracowni nie wolno palić tytoniu, spożywać posiłków i napojów, aplikować
kosmetyków. Nie używać do celów spożywczych naczyń laboratoryjnych.
Odczynniki należy przechowywać w odpowiednim porządku. Nie wolno
trzymać żadnych substancji w niepodpisanych opakowaniach. Łatwopalne
rozpuszczalniki, a także stężone kwasy i zasady można przechowywać w
pracowniach pod wyciągiem tylko w ilościach zaspokajających bieżące
potrzeby.
Prace z rozpuszczalnikami organicznymi należy prowadzić przy sprawnie
działającej wentylacji. Podczas pracy nie wolno używać otwartego ognia.
Etanol używany w pracowni jest skażony.
Prace z kwasami i zasadami należy prowadzić pod sprawnie działającym
wyciągiem chemicznym.
Nigdy nie należy pipetować ustami substancji trujących, żrących lub innych
szkodliwych dla zdrowia.
Odpadów substancji, które mogą stanowić zagrożenie dla środowiska
naturalnego, nie wolno wylewać do zlewów. Należy je zlewać do szczelnych
podpisanych butelek i przechowywać pod wyciągiem. Będą okresowo
zbierane do zniszczenia.
Odpady innych stężonych substancji można wylewać do zlewu po ich
znacznym rozcieńczeniu, obficie spłukując wodą z kranu.
Okna w pracowni można tylko uchylać w pozycji pionowej. Nie otwierać ich
na oścież.
W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku należy niezwłocznie
powiadomić opiekującego się pracownią pracownika dydaktycznego.
3/ 33
Wstęp
Szanowni Państwo,
Witamy na pracowni "Białka i kwasy nukleinowe".
Głównym celem naszych zajęć jest zapoznanie Państwa z metodami oczyszczania
i frakcjonowania białek. Wszystkie ćwiczenia wykonują Państwo w parach. Każdy
wykona zestaw czterech ćwiczeń. Ćwiczenie pierwsze (Białka HMG) zawiera
elementy klasycznej i żmudnej procedury oczyszczania białek (homogenizacja
materiału biologicznego i wyodrębnianie frakcji bogatej w oczyszczane białko,
ekstrakcja, różnicowe wytrącanie, dializa, chromatografia jonowymienna,
przygotowanie próbek do elektroforezy, elektroforeza białek i wizualizacja białek
w żelu). Ćwiczenie drugie wykorzystuje natomiast nowoczesne złoża stosowane
w chromatografii powinowactwa, umożliwiające oczyszczenie białka w krótkiej,
jednoetapowej procedurze. Oczyszczenie ludzkiego SF2/ASF z komórek E. coli
opiera się na oddziaływaniu z kompatybilnym złożem dodanego do SF2/ASF
metodami inżynierii genetycznej znacznika, który stanowi w jednym przypadku
krótka sekwencja aminokwasowa a w drugim określone białko. W przeciwieństwie
do pierwszego ćwiczenia, w którym złoże do oczyszczania białek ułożone jest w
kolumnie chromatograficznej, ćwiczenie drugie jest przykładem zastosowania
złoża bez potrzeby użycia kolumny. Ćwiczenie to jest także przykładem tzw.
mikropreparatyki. W ćwiczeniu trzecim zapoznają się Państwo z metodą
elektroforetycznego rozdzielenia białek bez ich uprzedniej denaturacji. Ćwiczenie
czwarte pozwoli Państwu poznać metodę sporządzania tzw. surowego lizatu
komórek HeLa i określenia aktywności topoizomerazy I, która nacina
superhelikalny DNA.
Podstawą zaliczenia fakultetu jest wykonanie wszystkich przewidzianych ćwiczeń i
uzyskanie oceny pozytywnej ze sprawdzianu. Oceniając Państwa będziemy brać
pod uwagę znajomość procedur, organizację pracy, jakość otrzymanych
preparatów, zdolność do skomentowania rezultatów eksperymentu oraz wynik
sprawdzianu kończącego ćwiczenia. Nie można poprawiać poszczególnych
ćwiczeń. W uzasadnionych przypadkach dopuszczalne jest powtórzenie analizy
elektroforetycznej uzyskanych preparatów.
Sprawdzian będzie składał się z kilku pytań opisowych. Pytania mogą dotyczyć
rozwiązywania problemów laboratoryjnych lub odnosić się do podstaw
teoretycznych metod pracy z białkami i DNA.
4/ 33
1.
2.
3.
1.
2.
3.
4.
Zakres tematyki obowiązujacy do kolokwium zaliczeniowego:
Izolacja białek ze źródeł „naturalnych” (np. grasicy cielęcej) i białek
rekombinowanych z systemów heterologicznych.
Metody oczyszczania białek ze szczególnym uwzglednieniem RÓŻNYCH
metod chromatograficznych.
Elektroforeza białek jako narzędzie analizy preparatów białkowych.
W trakcie całych zajęć prosimy o:
Bezwzględne przestrzeganie regulaminu pracowni.
Prowadzenie dziennika laboratoryjnego zawierającego obliczenia i
notatki związane z wykonywanymi ćwiczeniami.
Wybieranie na każdych ćwiczeniach osoby odpowiedzialnej za
pozostawienie porządku w pracowni.
Ogólną dbałość o salę.
Życzymy Państwu przyjemnych ćwiczeń,
Zespół prowadzący
5/ 33
Literatura ogólna
1.
2.
3.
4.
Hames, B.D., Hooper, N.M. i Houghton, J.D. (1999) Krótkie wykłady:
biochemia. PWN, Warszawa.
Kłyszejko-Stefanowicz, L., red. (1999) Ćwiczenia z biochemii. PWN,
Warszawa.
Witwicki, J. i Ardelt, W., red. (1984) Elementy enzymologii. PWN, Warszawa.
autor anonimowy (1998) Protein purification. handbook. Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/
upp00919.nsf/Content/862381B4A8A84D5DC125726C0002CD93/$file/
18114275AC.pdf)
Osobom, które nie uczestniczyły w zajęciach „Biologia molekularna”,
zalecamy zapoznanie się z komentarzem do tych ćwiczeń zamieszczonym na
stronie: www.biol.uw.edu.pl/zbm/
Zespół prowadzący zajęcia
1.
2.
3.
4.
5.
Jan Fronk, pok. 103/D, tel.: (+22) 55-43-103
Takao Ishikawa, pok. 105/D, tel.: (+22) 55-43-105
Barbara Kowalska-Loth, pok. 115/D, tel.: (+22) 55-43-115
Piotr Kozłowski, pok. 108/D, tel.: (+22) 55-43-108
Joanna Trzcińska-Danielewicz, pok. 108/D, tel.: (+22) 55-43-108
6/ 33
Ćwiczenie 1
Oczyszczanie białek HMG z grasicy
cielęcej
WSTĘP
Białka HMG (High Mobility Group od ich ruchliwości na żelu podczas
elektroforezy) należą do grupy białek strukturalnych chromatyny. Białka HMG są
związane z chromatyną słabiej niż histony i dają się ekstrahować z chromatyny już
0,35 M chlorkiem sodu. Wszystkie białka HMG są rozpuszczalne w
2% kwasie trójchlorooctowym (TCA), które dzieli się na dwie grupy:
•
rozpuszczalne w 10% TCA, małocząsteczkowe (m.cz. ok. 10-12 kDa):
HMG 14 i HMG 17,
•
nierozpuszczalne w 10% TCA, wielkocząsteczkowe (m.cz. ok. 26 kDa):
HMG 1 i HMG 2 (stanowiące dominującą ilościowo grupę wśród białek
HMG).
Ćwiczenie polega na wyizolowaniu chromatyny z grasicy cielęcej, ekstrakcji białek
HMG 0,35 M chlorkiem sodu i oczyszczeniu białek HMG 1 i HMG 2 przy użyciu
chromatografii jonowymiennej na kolumnie z CM-Sephadex C25 (kationit z grupą
karboksymetylową).
Frakcje uzyskane w trakcie całej preparatyki zostaną poddane analizie na żelu
poliakryloamidowym zawierającym SDS (ryc. 1).
Ryc. 1. Obraz elektroforetyczny preparatów białek HMG 1 i HMG 2 na
poszczególnych etapach oczyszczania. Z lewej strony wzorce masy cząsteczkowej.
W czwartej studzience oczyszczone białka HMG 1 i HMG 2.
7/ 33
PROCEDURA
Uwagi ogólne:
1.
W tym ćwiczeniu wszystkie bufory potrzebne do izolacji należy
przygotować samodzielnie w oparciu o stężone roztwory przygotowane
przez prowadzących (oznaczone  ).
2.
Białka HMG bardzo łatwo ulegają degradacji przez obecne w grasicy
peptydazy. Dlatego też, izolację białek HMG należy wykonywać zawsze w
obecności świeżo dodanego (niestabilny w roztworze wodnym) inhibitora
peptydaz fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) oraz w temperaturze
poniżej 4oC. Ćwiczenie należy wykonać w pracowni, trzymając próbki w
lodzie i używając schłodzonych buforów, z wyjątkiem dializy i kolumny,
które należy wykonać w chłodni. Na zajęciach poprzedzających ćwiczenia
wymagające użycia wirówki K-23 przygotować probówki szklane wraz z
gilzami, wstępnie zrównoważyć i pozostawić w lodówce do następnych
zajęć do schłodzenia.
3.
 PMSF jest groźny dla błon śluzowych, oczu i skóry. Nigdy nie pipetować
ustami. W przypadku kontaktu z PMSF należy natychmiast przemyć
skórę (oczy) dużą ilością wody.
4.
 β-merkaptoetanol jest trucizną. Nigdy nie pipetować ustami. Stężonych
roztworów używać tylko pod włączonym wyciągiem chemicznym. W
przypadku kontaktu z β-merkaptoetanolem należy natychmiast przemyć
skórę dużą ilością wody.
Materiał biologiczny:
Zamrożona grasica cielęca.
Odczynniki:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
 1 M Tris-HCl, pH 7,5
 1 M Tris-HCl, pH 8,0
 0,5 M EDTA, pH 8,0
 5 M NaCl
 100 mM PMSF w 96 % etanolu
 14,3 M β-merkaptoetanol
8/ 33
7.
Bufor do homogenizacji:
75 mM NaCl
25 mM EDTA, pH 8,0
10 mM Tris-HCl, pH 7,5
0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem
odpowiednią ilość roztworu [5])
8. Bufor do ekstrakcji:
0,35 M NaCl
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
9.  100% (w/v) kwas trójchlorooctowy (TCA)
10.  70% etanol
11. Bufor do dializy:
50 mM NaCl
10 mM β-merkaptoetanol
12. Zawiesina CM-Sephadex C25 (dodać 0,5 g CM-Sephadex C25 do 200 ml
buforu do dializy [11])
Uwaga !!! Przygotować na ćwiczeniach poprzedzających chromatografię i
pozostawić w lodówce do spęcznienia.
13. Bufor do elucji "niska sól":
0,3 M NaCl
14. Bufor do elucji "wysoka sól":
0,5 M NaCl
15.  100 mM Tris-HCl, pH 8,0
16.  Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt 1)
9/ 33
Wykonanie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
2 g drobno pokrojonej grasicy homogenizować w 150 ml buforu
homogenizacyjnego [7] (w schłodzonym mikserze 2 razy po 1 minucie przy
maksymalnych obrotach).
Homogenat rozlać do schłodzonych szklanych probówek wirówkowych na
100 ml i zrównoważyć probówki wraz z zimnymi gilzami.
Homogenat wirować przy 3000 rpm przez 10 min. w 4oC w uprzednio
schłodzonej wirówce K23.
Delikatnie zlać supernatant. Do osadu dodać około 70-100 ml buforu
homogenizacyjnego [7], osad zawiesić bagietką i wirować jak wyżej.
Powtórzyć przemycie opisane w pkt. 4. Otrzymany osad chromatyny
niezwłocznie użyć do izolacji HMG.
Do osadu chromatyny dodać 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesić osad
bagietką i odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.
Supernatant przenieść do nowej szklanej probówki wirówkowej na 100 ml, zaś
do osadu dodać kolejne 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesić osad
bagietką i odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.
Supernatant połączyć z poprzednim supernatantem i wymieszać. Do probówki
typu Eppendorf (oznaczonej nr 1) pobrać 200 µl połączonego supernatantu,
dodać 50 µl 100% TCA [9], wymieszać i pozostawić w lodówce (nie
zamrażać!) jako próbkę do elektroforezy.
Zmierzyć objętość pozostałego supernatantu i dodać do niego 100% TCA [9]
do końcowego stężenia 2%.
Odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.
Otrzymany supernatant przenieść do nowej szklanej probówki wirówkowej na
100 ml, dodać 100% TCA [9] do końcowego stężenia 12% i pozostawić do
następnych ćwiczeń w lodówce (nie zamrażać!).
Odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 15 min. Supernatant
odrzucić.
Uwaga !!! Przy zlewaniu supernatantu bardzo łatwo zgubić drobny osad!
Osad przemyć 5 ml 70% etanolu [10] i odwirować w wirówce K23 przy 3000
rpm przez 15 min.
Osad podsuszyć w strumieniu zimnego powietrza z suszarki. W czasie
suszenia nie trzymać probówek w lodzie.
W trakcie suszenia osadu namoczyć otrzymany od prowadzących woreczek
dializacyjny w buforze do dializy [11].
Podsuszony osad rozpuścić w 1 - 2 ml buforu do dializy [11] i przenieść do
woreczka dializacyjnego. Probówkę przepłukać 0,5 ml buforu do dializy [11] i
następnie dodać go do woreczka dializacyjnego.
Preparat dializować w chłodni przez 30 min. wobec 250 ml buforu do dializy
[11], wymienić bufor do dializy na świeży i prowadzić dializę kolejne 30 min.
10/33
18. W trakcie dializy uformować w chłodni 1 ml kolumnę z przygotowanej
wcześniej zawiesiny CM-Sephadex C25 [12], kolumnę zrównoważyć poprzez
przemycie 10 ml buforu do dializy [11].
19. Po zakończeniu dializy przenieść preparat z woreczka do 15 ml probówki typu
Falcon. Do probówki typu Eppendorf (oznaczonej nr 2) pobrać 200 µl
preparatu po dializie, dodać 50 µl 100% TCA [9], wymieszać i pozostawić w
lodówce (nie zamrażać!) jako kolejną próbkę do elektroforezy.
20. Nanieść na kolumnę resztę preparatu po dializie i zacząć zbierać wyciek do
15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 3). Kiedy poziom roztworu
zrówna się z górną powierzchnią złoża, na złoże delikatnie nawarstwić 10 ml
buforu do dializy [11]. Dalej zbierać wyciek do tej samej probówki (nr 3).
21. Przeprowadzić elucję 5 ml buforu do elucji "niska sól" [13]. Zebrać całość
wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 4).
22. Przeprowadzić elucję 5 ml buforu elucji "wysoka sól" [14]. Zebrać całość
wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 5).
23. Zawartość probówek nr 3, 4 i 5 wymieszać, do każdej dodać 100% TCA [9] do
końcowego stężenia 20% (po 0,2 ml TCA na każde 0,8 ml wycieku),
wymieszać i pozostawić do następnych ćwiczeń w lodówce (nie zamrażać!).
24. Probówki oznaczone nr 1 i 2 odwirować w mikrowirówce przez 10 min.,
probówki oznaczone nr 3, 4 i 5 odwirować w wirówce Haereus przy 3000 rpm
przez 15 min. Supernatanty zlać, zaś otrzymane osady (mogą być słabo
widoczne) przemyć 70% etanolem [10] (osady z probówek nr 1 i 2 - 1 ml , a
osady z probówek 3, 4 i 5 - 5 ml), odwirować jak wyżej i starannie usunąć
supernatanty znad osadów.
25. Osady wysuszyć strumieniem zimnego powietrza z suszarki.
26. Przygotować próbki do elektroforezy; wysuszone osady zawiesić w 30 µl
100 mM Tris-HCl [15], następnie do każdej z próbek dodać 7,5 µl buforu
Laemmli'ego 5x [16].
Uwaga !!! Jeśli po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni się z
fioletowego na pomarańczowy, należy skonsultować się z prowadzącymi.
Przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20°C.
27. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych próbek w 15% żelu
poliakryloamidowym zawierającym SDS (zob. Appendix pkt. 1), nakładając
po 25 µl każdej próbki i zachowując resztę w zamrażalniku na wypadek
konieczności powtórzenia elektroforez.
Literatura do ćwiczenia:
1.
2.
3.
Goodwin, G.H., Nicolas, R.H. i Johns, E.W. (1975) Biochim. Biophys. Acta
405, 280291.
Johns, E.W. (1982) The chromosomal proteins. Academic Press, London.
Kłyszejko-Stefanowicz, L. (1995) Cytobiochemia. PWN, Warszawa.
11/33
Ćwiczenie 2
Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego
białka SF2/ASF z komórek bakterii
Escherichia coli
WSTĘP
Biolodzy molekularni chcąc uzyskać interesujące go białko w dużych ilościach
sięgają często po techniki izolacji rekombinowanych białek w układzie
heterologicznym. W tym celu konstruuje się wektor ekspresyjny niosący cDNA
interesującego białka z dołączonym znacznikiem pozwalającym na wydajną
izolację rekombinowanego białka metodą chromatografii powinowactwa. Jednak
to, czy rekombinowane białko będzie dogodnym modelem do badań, zależy w
znacznej mierze od jego naturalnych właściwości. Trudności z izolacją danego
białka można ominąć stosując różne warunki hodowli i izolacji, zmieniając
docelowe komórki do produkcji, a także dołączając różne rodzaje znaczników. W
niektórych wypadkach pomocne może być wyrażanie w systemie heterologicznym
skróconego białka, np. pozbawionego "problematycznych" domen białkowych.
Niniejsze ćwiczenie ma na celu zbadanie wpływu przyłączonego znacznika i
długości wyrażanego polipeptydu na sposób i wydajność izolacji białka. Badanymi
znacznikami są: sekwencja sześciu histydyn (6xHis) oraz białko transferazy
glutationowej ze Schistosoma japonicum (GST).
Ćwiczenie polega na oczyszczeniu z bakterii Escherichia coli białka ludzkiego
czynnika splicingowego 2 (SF2/ASF). W cząsteczce białka SF2/ASF (248 reszt
aminokwasowych) można wyróżnić dwie domeny RRM (RNA Recognition Motif),
które obejmują aminokwasy [1-194] i domenę SR bogatą w powtórzenia seryna/
arginina (pozostała część białka). Domena SR zmniejsza rozpuszczalność białka
SF2/ASF i jej obecność powoduje, że w komórkach ssaków SF2/ASF jest
gromadzony w postaci tzw. spekli (z ang. speckles), a w komórkach bakteryjnych
jest słabo rozpuszczalny. Dopiero fosforylacja reszt serynowych w powtórzeniach
SR zwiększa rozpuszczalność SF2/ASF.
W ćwiczeniu wykorzystane zostaną trzy konstrukty niosące cDNA białka SF2/ASF
– jeden z przyłączonym znacznikiem 6xHis, dwa w fuzji z GST, z których jeden
niesie sekwencję kodująca pełne białko SF2/ASF, a drugi tylko jego domeny RRM
(SF2/ASF[1-194]).
Sporządzenie pierwszego konstruktu zakłada oczyszczanie SF2/ASF z
dołączonym znacznikiem 6xHis przy pomocy chromatografii powinowactwa na
12/33
unieruchomionych jonach metali. W przypadku tego ćwiczenia izolacja zostanie
przeprowadzona w warunkach denaturujących. W oczyszczaniu w warunkach
denaturujących zawartość komórek rozpuszcza się w silnych i stężonych
detergentach; 6 M chlorowodorku guanidyny lub 8 M moczniku. Silne detergenty
mogą upłynniać także nierozpuszczalne agregaty białek powstające często przy
wysokim poziomie ekspresji rekombinowanego białka (np. ciała inkluzyjne w E.
coli). Jako złoże użyta będzie agaroza zawierająca jony Ni2+ chelatowane kwasem
nitrylotrójoctowym (Ni-NTA agaroza). Białka posiadające rejon bogaty w reszty
histydynowe łączą się z Ni-NTA agarozą w neutralnym pH z dużym
powinowactwem (Kd = 10-13). Związane ze złożem białka wymywa się buforem o
niższym pH (obniżenie pH powoduje uprotonowanie histydyny, a w konsekwencji
ich oddysocjowanie od kompleksu Ni-NTA) lub dużym stężeniem imidazolu.
Na oczyszczanie białka SF2/ASF i SF2/ASF[1-194] w fuzji z GST pozwala
zastosowanie złoża agarozowego z dołączonym kowalencyjnie zredukowanym
glutationem. Zredukowany glutation jest naturalnym substratem dla glutationotransferazy i wiąże się z dużym powinowactwem w zakresie pH od 6,5 do 9,5.
Związane ze złożem białka wymywa się nadmiarem glutationu.
His-SF2/ASF będzie oczyszczany z bakterii E. coli TG1 zawierających wektor
ekspresyjny pTRCHis (ryc. 2), kodujący SF2/ASF z dołączoną na jego N-końcu
sekwencją sześciu histydyn (His-SF2/ASF) pod kontrolą promotora
indukowalnego przez izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG).
GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194] będą oczyszczane z bakterii E. coli BL21DE3 zawierających wektor ekspresyjny pGEX-4T (ryc. 3) kodujący GST, do
którego wprowadzono fragmenty DNA kodujące SF2/ASF lub SF2/ASF[1-194]
tak, aby powstające białko fuzyjne posiadało GST na N-końcu. Gen białka
fuzyjnego znajduje się pod kontrolą promotora indukowalnego przez IPTG.
Frakcje uzyskane podczas oczyszczania zostaną poddane analizie na żelu
poliakryloamidowym zawierającym SDS. His-SF2/ASF migruje w żelu
poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie cząsteczkowej około 35 kDa.
GST-SF2/ASF migruje w żelu poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie
cząsteczkowej około 50 kDa. GST-SF2/ASF[1-194] migruje w żelu
poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie cząsteczkowej około 45 kDa.
13/33
Ryc. 2. Wektor bakteryjny pTrcHis z kasetą ekspresyjną zawierającą:
(i) Regulowany, silny promotor trc z sekwencją operatorową operonu
laktozowego, pozwalający na indukcję ekspresji przez dodanie do hodowli
IPTG,
(ii) Antyterminator,
(iii) Syntetyczne miejsce wiązania rybosomu,
(iv) Kodon "start",
(v) Sekwencję kodującą sześć reszt histydynowych,
(vi) Miejsce wklonowania pożądanego cDNA,
(vii) Terminator transkrypcji.
14/33
Ryc. 3. Wektor bakteryjny pGEX 4T z kasetą ekspresyjną zawierającą:
(i) Regulowany, silny promotor tac z sekwencją operatorową operonu
laktozowego, pozwalający na indukcję ekspresji przez dodanie do hodowli
IPTG,
(ii) Syntetyczne miejsce wiązania rybosomu,
(iii) Kodon "start",
(iv) Sekwencję kodującą transferazę glutationową,
(v) Miejsce wklonowania pożądanego cDNA,
(vi) 2 kodony "stop",
(vii) Terminator transkrypcji
Podsumowując, ćwiczenie składa się z trzech części:
(a) oczyszczanie rekombinowanego białka His-SF2/ASF w warunkach
denaturujących
(b) oczyszcznie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF w warunkach
natywnych
(c) oczyszczanie rekombinowanego polipeptydu obejmującego domeny RRM
białka SF2/ASF – GST-SF2/ASF[1-194] w warunkach natywnych.
15/33
PROCEDURA
Uwagi ogólne:
1.
Wykonanie ćwiczenia należy podzielić na dwa dni zajęć – jednego dnia
wykonać oczyszczanie białka His-SF2/ASF, drugiego oczyszczanie białek
w fuzji z GST. GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194] należy oczyszczać
równolegle, w ten sposób, że każda osoba z pary zajmuje się jednym z
białek.
2.
Próby ze wszystkich trzech części będą analizowane na jednym żelu
poliakryloamidowym.
3.
Jeśli nie zostało podane inaczej, po pobraniu prób do analizy
elektroforetycznej wszystkie frakcje chromatograficzne należy zamrozić i
zachować do momentu obejrzenia wyników, na wypadek konieczności
wykonania dodatkowej elektroforezy.
5.
Wszystkie wirowania należy wykonać w mikrowirówce przy
maksymalnych obrotach.
6.
W ćwiczeniu używa się małych ilości złóż chromatograficznych, które
łatwo zgubić na poszczególnych etapach. Należy postępować z nim
ostrożnie, szczególnie uważając, aby po wirowaniu nie wciągnąć pipetą
złoża razem z supernatantem.
1. Oczyszczanie rekombinowanego białka His-SF2/ASF (warunki
denaturujące)
Uwagi ogólne:
Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej.
Procedura wykonana przed ćwiczeniami:
Do komórek bakterii E. coli, szczep TG1 wprowadzono plazmid pTrcHis niosący
sekwencję kodującą białko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w podłożu
płynnym w temp. 37°C z wytrząsaniem. Gdy hodowla osiągnęła OD600=0,9
(gęstość optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm),
pobrano część bakterii jako próbę nieindukowaną a w pozostałej hodowli
indukowano ekspresję His-SF2/ASF (0,25 mM IPTG, przez 4 godz.). Po
zakończeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w buforze PBS (skład
zob. część (b)) i poddano sonikacji. Tak samo postąpiono z bakteriami
nieindukowanymi IPTG.
16/33
zamrożona po sonikacji zawiesina bakterii E. coli wyrażających
rekombinowane ludzkie białko His-SF2/ASF
Odczynniki:
1.

2.
3.


4.

5.

Bufor B:
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris-HCl pH 8,0
8 M mocznik
50% zawiesina Ni-NTA agarozy w buforze B (100 µl)
Bufor do płukania:
bufor B pH 6,4
Bufor do elucji:
bufor B pH 4,0
Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt. 1)
Wykonanie:
1.
2.
Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.
Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml
otrzymane od prowadzących). Z supernatantu pobrać 5 µl i przenieść do
probówki podpisanej A1, zachować do elektroforezy. Supernatant odrzucić a
osad zawiesić w 2 ml buforu B [1] i inkubować z mieszaniem przez 40 min.
3. Odwirować przez 10 min. Supernatant zebrać do nowej 2 ml probówki. Z
supernatantu pobrać 20 µl i przenieść do probówki podpisanej A2, zachować
do elektroforezy.
4. Supernatant przenieść do probówki z zawiesiną Ni-NTA agarozy [2].
5. Inkubować ze złożem przez 1 godz. z mieszaniem, następnie odwirować
przez 1 min.
6. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej
probówki.
7. Złoże przepłukać 3×1 ml buforu B [1]. Za każdym razem kilkakrotnie
wstrząsnąć probówką i wirować przez 1 min., następnie zebrać supernatant
znad złoża, pierwszą porcję przenieść do nowej probówki, pozostałe można
wylać.
8. Złoże przepłukać 1 ml buforu do płukania [3]. Wirować j.w., zebrać
supernatant i przenieść do nowej probówki.
9. Białko eluować 4 razy porcjami po 80 µl buforu elucyjnego [4]. Wirować j.w.
i zebrać wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej
pobrać po 5 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej A3,
zachować do elektroforezy.
10. Następnie do probówek A1, A2 i A3 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5×
17/33
[5]. Dodatkowo do elektroforezy przygotować próbkę kontrolną A0,
otrzymaną od prowadzących. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji
zawiesiny bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]).
Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C.
Uwaga !!! Jeśli po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni się z
fioletowego na pomarańczowy, należy dodać kroplę NaOH.
2. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF (warunki
natywne)
Uwagi ogólne:
1.
Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej,
trzymając próby w lodzie i używając schłodzonych buforów.
2.
Zwróć uwagę, że w tej części ćwiczenia stosuje się bufor PBS o dwóch
różnych stężeniach: 10× i 1×
Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T
niosący sekwencję kodującą białko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w podłożu
płynnym w temp. 37°C z wytrząsaniem. Gdy hodowla osiągnęła OD600=0,8
(gęstość optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm),
pobrano część bakterii jako próbę nieindukowaną a w pozostałej hodowli
indukowano ekspresję GST-SF2/ASF (0,5 mM IPTG, przez 3 godz.). Po
zakończeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w 10 mM βmerkaptoetanolu w H2O i sonikowano. Tak samo postąpiono z bakteriami
nieindukowanymi IPTG.
rekombinowane ludzkie białko GST-SF2/ASF
Odczynniki:
1.

PBS 10×
1,4 M NaCl
27 mM KCl
100 mM Na2HPO4
18 mM KH2PO4, pH 7,3
18/33
2.
3.
4.
5.
PBS 1×
0,14 M NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1,8 mM KH2PO4, pH 7,3
 50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1× (100 µl)
 Bufor do elucji:
20 mM glutation
 Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt. 1)
Wykonanie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.
Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml
probówki podpisanej B1, zachować do elektroforezy. Do pozostałego
supernatnatu (ok. 2 ml) dodać 1/10 objętości PBS 10× [1] i wymieszać.
Przenieść supernatant do probówki z zawiesiną glutationo-agarozy [3].
Inkubować ze złożem przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze
pokojowej, następnie odwirować przez 1 min.
Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej
probówki.
Złoże przepłukać 3×1 ml PBS 1× [2]. Za każdym razem kilkakrotnie
wylać.
Białko eluować 2×100 µl buforu elucyjnego [4], Wirować j.w. i zebrać
wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać
po 10 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej B2, zachować
do elektroforezy.
Następnie do probówek B1 i B2 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5× [5].
Dodatkowo do elektroforezy przygotować próbkę kontrolną B0, otrzymaną
od prowadzących. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji zawiesiny
bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]). Próbki do
elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C.
19/33
3. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF[1-194]
(warunki natywne)
Uwagi ogólne:
Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej, trzymając
próby w lodzie i używając schłodzonych buforów.
Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T
niosący sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka SF2/ASF
odpowiadający domenom RRM (SF2/ASF[1-194]). Ekspresję prowadzono tak, jak
w przypadku pełnego bialka SF2/ASF (zob. część (a)) Po zakończeniu ekspresji
bakterie odwirowano, zawieszono w buforze PBS 1× (zob. niżej) i sonikowano.
rekombinowane ludzkie białko GST-SF2/ASF[1-194]
Odczynniki:
1. PBS 1×
2.  50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1× (100 µl)
3.  Bufor do elucji:
20 mM glutation
4.  Bufor Laemmli'ego 5× (zob. Appendix pkt. 1)
Wykonanie:
1. Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.
2. Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml
probówki podpisanej C1, zachować do elektroforezy.
3. Przenieść supernatant do probówki z zawiesiną glutationo-agarozy [2].
4. Inkubować ze złożem przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze
pokojowej, następnie odwirować przez 1 min.
5. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej
probówki.
6. Złoże przepłukać 3×1 ml PBS 1× [1]. Za każdym razem kilkakrotnie
wylać.
20/33
7.
8.
Białko eluować 2×100 µl buforu elucyjnego [3], Wirować jw. i zebrać
wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać
po 10 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej C2, zachować
do elektroforezy.
Następnie do probówek C1 i C2 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5× [4].
Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C.
4. Analiza elektroforetyczna
Po wykonaniu wszystkich części ćwiczenia 2 przeprowadzić rozdział
elektroforetyczny przygotowanych prób w 12% żelu poliakryloamidowym
zawierającym SDS, nakładając po 20 µl prób A0 – A3, B0 – B2, C1, C2 oraz
całość mieszaniny białek wzorcowych otrzymanej od prowadzących (zob.
Appendix pkt. 1).
1.
2.
3.
4.
5.
Hoffman, A. i Roeder, R.G. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 6337-6338.
autor anonimowy (2003) The QIAexpressionist: a handbook for high-level
expression and purification of 6xHis-tagged proteins. QIAGEN, Hilden.
(http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressionist_EN)
http://www.sigmaaldrich.com (szukaj opisu dla "N 3158")
autor anonimowy (2002) GST Gene Fusion Systems – Handbook, Amersham
Biosciences. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/
87478CFA7E09E0C7C1256EB400417E59/$file/18115758.pdf)
autor anonimowy (2007) Affinity chromatography. Principles and methods,
GE Healthcare (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/
91D3DF5DE303E8B6C1256EB400417F34/$file/18102229AE.pdf)
21/33
Ćwiczenie 3
Elektroforeza natywna białek- BN-PAGE
(Blue native electrophoresis)
WSTĘP
Oprócz popularnie stosowanej elektroforezy denaturującej w systemie
Laemmlie’go, którą znają Państwo z szeregu wcześniejszych ćwiczeń istnieją też
inne systemy rozdziału białek, zarówno denaturujące jak i natywne. To ćwiczenie
ma na celu zapoznanie Państwa z jedną z odmian elektroforezy natywnej. Białka w
roztworze wodnym, w pH różnym od ich punktu izoelektrycznego (pI), są
cząsteczkami wykazującymi ładunek wypadkowy różny od zera, czyli są jonami o
przewadze któregoś z ładunków (w pH powyżej pI są anionami, w pH poniżej pI są
kationami). Na kierunek migracji ma wpływ znak jonu, zaś na tempo migracji
wielkość ładunku oraz wielkość i kształt cząstki. Cząsteczki o większym ładunku i
mniejszym promieniu cząstki wędrują szybciej. Problemem w takim systemie jest
rozdział białek zasadowych w standardowych aparacikach używanych w
laboratorium i w dostępnych systemach buforowych. Rozwiązaniem jest
opłaszczenie białek ładunkiem ujemnym bez ich jednoczesnej denaturacji.
Uzyskujemy to stosując niebieski barwnik Serva Blue G który jest anionem i
łącząc się z białkami nadaje im wypadkowy ujemny ładunek. Elektroforeza BNPAGE jest prowadzona w obecności tego barwnika.
Elektroforezą natywną można rozdzielać kompleksy białek i sprawdzać obecność
form oligomerycznych. Wymaga ona jednakże większych ilości białek niż
elektroforeza denaturująca.
Państwa zadaniem będzie rozdzielenie otrzymanych od prowadzących próbek
białek za pomocą elektroforezy denaturującej oraz natywnej i porównanie
wyników.
Uwagi ogólne:
Elektroforezę natywną należy prowadzić w nieobecności detergentu! Należy
dokładnie umyć szybki oraz aparat przed przystąpieniem do wylania żelu i
rozdziału. Próbek do rozdzielenia jest 4, więc zarówno elektroforezę natywna
jak i denaturującą rozdzielają po 2 pary na każdym żelu.
22/33
Próbki białek otrzymane od prowadzących:
1. białka UP1-TAT, EGFP-TAT, GST, albumina w ilości 5 µg (elektroforeza
natywna)
2. białka UP1-TAT, EGFP-TAT, GST, albumina w ilości 0,5 µg (elektroforeza
denaturująca)
Do próbek nanoszonych na elektroforezę natywną należy dodać odpowiednią ilość
10 mM Tris-HCl pH 8,0, która ułatwi nanoszenie próbek na żel
poliakryloamidowy.
Odczynniki:
1. Przygotowanie żelu natywnego:
Żel rozdzielający 10%:
2 ml mieszaniny monomerów akryloamidu,
0,8 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8,
3,2 ml wody,
40 µl APS,
5 µl TEMED
Żel zagęszczający 4%:
0,2 ml mieszaniny monomerów akryloamidu,
0,82 ml wody,
0,48 ml 0,625 M Tris-HCl pH 6,8,
20 µl APS,
4 µl TEMED
 naważka barwnika Serva Blue G

Bufor katodowy (około 100 ml):
100 mM glicyna doprowadzona Tris Base do pH 8,0, po nałożeniu
próbek zmieszać z 0,002% Serva Blue G (należy uprzednio rozpuścić w
małej ilości buforu katodowego)

Bufor anodowy (około 200 ml): 100 mM Tris-HCl pH 8,8
Barwnik do próbek : 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 40% glicerol, 0,5% Serva Blue G
Wykonanie:
Elektroforeza natywna:
1. Aparat do elektroforezy należy starannie wypłukać z pozostałości SDS,
podobnie szybki i inne przybory.
2. Wylać żel.
3. Próbki białka wymieszać z barwnikiem do próbek, pozostawić na 10 min. i
nanieść na żel.
23/33
4. Po naniesieniu próbek ostrożnie wymieszać naważkę barwnika z buforem
katodowym w aparacie.
5. Rozdzielić białka przy natężeniu prądu około 15 mA. W połowie przebiegu
należy przerwać na chwilę rozdział i wymienić bufor katodowy na nową porcję
bezbarwnego buforu.
Elektroforeza denaturująca:
Rozdzielić próbki metodą denaturującą zgodnie z opisem w Appendix pkt 1. W
pierwszej kieszonce należy nanieść wzorce.
1. Michael Niepmann, Junfeng Zheng , Discontinuous native protein gel,
electrophoresis , Electrophoresis 2006, 27, 3949-3951
24/33
Ćwiczenie 4
Oznaczanie aktywności ludzkiej
topoizomerazy I w ekstraktach jądrowych
komórek HeLa
Ludzka topoizomeraza I jest jądrowym enzymem katalizującym reakcję
relaksacji DNA. Oznaczenie aktywności tego enzymu wykonuje się badając
zdolność do relaksacji superhelikalnego plazmidu przez kolejne rozcieńczenia
preparatu enzymu. W niniejszym ćwiczeniu aktywność enzymu definiujemy jako
ilość topoizomerazy I potrzebną do zrelaksowania w ciągu 0,5 godziny w 37oC
0,1µg plazmidu pBR322 w 50 procentach.
Ćwiczenie polega na przygotowaniu ekstraktu jądrowego komórek HeLa i
oznaczenie w nim aktywności topoizomerazy I.
Materiał biologiczny: 10 mln komórek HeLa przepłukanych buforem PBS
i zamrożonych.
Odczynniki:
 Bufor P2: 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM Tris-HCl pH
7,8
 10% Triton X-100 w buforze P2
 5 M NaCl
 100 mM PMSF
 1,4% agaroza w buforze TAE
 bufor TAE
 preparat plazmidu pBR322
 Bufor relaksacyjny: 120 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 10
mM β-merkaptoetanol, 40 mM Tris-HCl pH 7,5
 Albumina 10 mg/ml
 bufor STOP: 27% sacharoza, 0,67% SDS, 67 mM EDTA, Orange G
Uwaga! Wszystkie czynności wykonywać w lodzie używając schłodzonych
probówek i wirówki. do buforu P2 dodać bezpośrednio przed użyciem PMSF do
stężenia 1 mM.
25/33
Wykonanie:
Przygotowanie ekstraktu jądrowego komórek HeLa
1. Osad komórek HeLa zawiesić w 2 ml buforu P2, dodać 20 µl roztworu
Tritonu X-100. Przenieść do małej szklanej zlewki.
2. Homogenizować poprzez przeciąganie roztworu przez strzykawkę z igłą
15 razy.
3. Roztwór przenieść do probówki Eppendorfa 2 ml i wirować przez 5 min.
przy 5 tys. obrotów.
4. Supernatant odrzucić a osad przepłukać 1 ml buforu P2. Odwirować j.w.
5. Powtórzyć płukanie, odwirować j.w.
6. Osad zawiesić w 200 µl buforu P2, starannie zmierzyć objętość próbki i
dodać NaCl do stężenia 0,42M. Ekstrakcję prowadzić 30 min. w lodzie z
mieszaniem na kołysce.
7. Odwirować przy 15 tys. obrotów w ciągu 10 min. Zebrać supernatant,
który stanowi frakcję ekstraktu jądrowego i zamrozić do następnych ćwiczeń.
Oznaczanie aktywności topoizomerazy I:
1. Pobrać 1 ml buforu reakcyjnego, dodać albuminę do stężenia 0,1 mg/ml.
2. Do 10 probówek Eppendorfa odpipetować po 5 µl plazmidu pBR 322. Do
probówki kontrolnej dodać 5 µl buforu reakcyjnego z albuminą.
3. W kolejnych probówkach Eppendorfa sporządzić następujace
rozcieńczenia ekstraktu jądrowego w buforze reakcyjnym z albuminą: 100x, 200x,
400x, 800x, 1600x, 3200x, 6400x, 12800x.
4. Do odpowiednio podpisanych probówek z plazmidem dodawać po 5 µl
każdego z rozcieńczeń enzymu.
5. Próbki zwirować przez 20 sek. i inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej
w 37oC. Następnie zwirować ponownie i dodać po 5 µl buforu STOP.
6. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny próbek w 1,4% żelu
agarozowym, pozwalając wyjść barwnikowi poza żel, po zakończeniu
elektroforezy żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, wykonać zdjęcie i
ocenić aktywność enzymu.
26/33
Appendix
1.
Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym
zawierającym SDS (SDS-PAGE)
Uwagi ogólne:
1.
2.
 Akryloamid przed polimeryzacją jest silnie trujący. Nigdy nie
pipetować ustami. Wszystkie czynności z akryloamidem wykonywać tylko
w rękawiczkach.
Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie pipetować ustami stężonego
kwasu. Odbarwianie żelu przeprowadzać pod włączonym wyciągiem
chemicznym.
Odczynniki:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
 Mieszanina monomerów:
30% (w/v) akryloamid
0,8% (w/v) N,N'-metylenobisakryloamid
 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
 0,625 M Tris-HCl, pH 6,8
 1% (w/v) SDS
 10% (w/v) nadsiarczan amonowy (APS)
 N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED)
 Bufor do elektoforezy (pH 8,3):
0,025 M Tris
0,192 M glicyna
0,1% (w/v) SDS
 Mieszanina białek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x:
220 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
31 kDa
21 kDa
16 kDa
 Bufor Laemmli'ego 5x:
0,325 M Tris-HCl, pH 6,8
10% (w/v) SDS
27/33
50% (w/v) glicerol
5% (v/v) β-merkaptoetanol
0,05% (w/v) błękit bromofenolowy
10.  Roztwór do barwienia żelu (do wielokrotnego użycia):
0,2% (w/v) błękit Coomassie'go R-250 w roztworze woda:metanol:st. kwas
octowy 5:5:1
11. 7,5% (v/v) kwas octowy
Wykonanie:
1.
2.
Złożyć ze sobą dwie bardzo czyste (przetarte dodatkowo etanolem) i suche
płytki szklane przedzielone szarymi przekładkami. Jedna z płytek powinna być
ustawiona wcięciem ku górze, zaś druga z płytek, dwoma zaokrąglonymi
rogami na dół. Wokół tej drugiej powinna być owinięta pomarańczowa
uszczelka zgrubieniem do środka (między płytki). Krawędzie górne płytek
powinny być na tej samej wysokości, ale przekładki i uszczelka mogą
wystawać powyżej górnych krawędzi płytek. Tak przygotowany komplet
szybek ustabilizować czterema dużymi białymi klamrami (dwie na dole i po
jednej na każdym boku). Między szybki włożyć biały grzebyk z 10 ząbkami.
Zaznaczyć markerem na szybce punkt ok. 3 mm poniżej dolnej krawędzi
ząbków grzebyka. Delikatnie wyciągnąć grzebyk.
Przygotować odpowiedni żel (10%-12%) mieszając ze sobą roztwory wg
kolejności w tabeli poniżej.
Uwaga !!! TEMED zawsze dodawać na chwilę przed wylaniem żelu.
Roztwór
10%
10%
12%
12%
4%
4%
1 żel 2 żele 1 żel 2 żele 1 żel
2 żele
Mieszanina monomerów [1] 2.00 ml 4.00 ml 2.40 ml 4.80 ml 0.20 ml 0.40 ml
Woda dejonizowana
1.90 ml 3.80 ml 1.50 ml 3.00 ml 0.90 ml 1.80 ml
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 [2] 1.50 ml 3.00 ml 1.50 ml 3.00 ml
-
-
-
-
0,625 M Tris-HCl, pH 6,8
[3]
1% SDS [4]
0.60 ml 1.20 ml 0.60 ml 1.20 ml 0.15 ml 0.30 ml
10% APS [5]
40 µl
80 µl
40 µl
80 µl
20 µl
40 µl
TEMED [6]
5 µl
10 µl
5 µl
10 µl
5 µl
10 µl
3.
-
-
0.30 ml 0.60 ml
Mieszaninę wlać między płytki szklane ustawione na plastikowej tacy aż do
poziomu zaznaczonego uprzednio na szybce. Na powierzchnię roztworu
ostrożnie nawarstwić wodę na wysokość ok. 1 cm. Tak przygotowany 10% lub
28/33
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
15% żel rozdzielający pozostawić do spolimeryzowania (około 30 min. w
temperaturze pokojowej, powinna pojawić się wyrażna granica między
spolimeryzowanym żelem a warstwą wody). Następnie zlać wodę znad żelu.
Pod koniec polimeryzacji żelu rozdzielającego przygotować 4% żel
zagęszczający mieszając ze sobą roztwory wg kolejności w tabeli powyżej.
Uwaga !!! TEMED zawsze dodawać na chwilę przed wylaniem żelu.
Mieszaninę nawarstwić na żel rozdzielający do krawędzi szybki z wcięciem.
Wsunąć grzebień i tak przygotowany żel zatężający pozostawić do
spolimeryzowania (około 30 min. w temperaturze pokojowej).
Ostrożnie wyciągnąć grzebyk, a następnie trzymając szybki zdjąć klamry i
gumową uszczelkę.
Umieścić żel w aparacie (szybką z wcięciem do środka aparatu), szybki
umocować w aparacie małymi białymi klamrami. Wlać bufor do elektroforezy
[7] do dolnego i górnego zbiornika.
Kieszonki w żelu przepłukać buforem do elektroforezy [7].
Próbki do elektroforezy (także mieszaninę białek wzorcowych [8] otrzymaną
od prowadzących) zawierające bufor Laemmli'ego [9] ogrzewać przez 3 min.
w 100oC.
Po zwirowaniu i schłodzeniu do temperatury pokojowej próbki nanieść na żel.
Włączyć chłodzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkręcić kran) i
podłączyć aparat do zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek,
elektroda dodatnia od dolnej krawędzi żelu).
Elektroforezę prowadzić przy napięciu około 100 V do czasu przesunięcia się
barwnika do dolnej krawędzi żelu (około 1,5 godz.).
Wyjąć szybki z żelem z aparatu, wyciągnąć przekładki i rozłożyć szybki
(delikatnie podważając jedną z nich). Obciąć warstwę żelu zagęszczającego (z
kieszonkami).
Żel umieścić w naczyniu z roztworem do barwienia żeli [10].
Żel barwić przez 20 min. (lub dłużej) w pudełku na plastikowej tacy.
Wyjąć żel z roztworu do barwienia [10] i odbarwiać go poprzez kilkukrotne
płukanie w 7% kwasie octowym [11] na gorąco (około 60-80oC) pod
wyciągiem chemicznym.
Literatura:
Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.
29/33
2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
Uwagi ogólne:
1.
2.
 Bromek etydyny jest silnym mutagenem i umiarkowanie silną trucizną.
Należy założyć rękawiczki przed każdą pracą z roztworami
zawierającymi bromek etydyny.
 Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest niebezpieczne i należy go
unikać. Żele należy oglądać w UV po przykryciu ich płytką szklaną i po
założeniu okularów.
Odczynniki:
1.
2.
3.
4.
5.
 Agaroza (w proszku)
 Bufor do elektroforezy TAE 1x:
40 mM Tris-octan, pH 7,6
1 mM EDTA
 Barwnik do elektroforezy oranż G 10x
0,4% (w/v) oranż G
50% (w/v) glicerol
 wzorzec wielkości: DNA, GeneRuler100 bp Plus (14 fragmentów DNA,
wielkość w bp: 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400,
300, 200 i 100 pz)
 bromek etydyny (1 µg/ml)
Wykonanie:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Odważyć 0,5 g agarozy [1] potrzebne do przygotowania 50 ml 1% żelu.
Do odważonej agarozy [1] dodać bufor do elektroforezy TAE 1x [2] i ogrzać
w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia się agarozy.
Złożyć aparacik do elektroforezy (włożyć przekładki i grzebień).
Po lekkim schłodzeniu agarozy, wylać żel o grubości około 0,5 cm (około
40 ml agarozy) i pozostawić go do zastygnięcia.
Usunąć przekładki i grzebień, zalać żel buforem. Podłączyć aparat do
zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej
krawędzi żelu) i sprawdzić, czy płynie prąd.
Odłączyć aparat od zasilacza. Próbki zawierające barwnik do elektroforezy
oranż G [3] oraz wzorce wielkości DNA [4] nanieść na żel i ponownie
podłączyć aparat.
Prowadzić elektroforezę przy napięciu 100 V do momentu przesunięcia się
pomarańczowego barwnika do dolnej krawędzi żelu.
Wyjąć żel z aparatu i włożyć do naczynia z roztworem bromku etydyny [5].
30/33
9.
Żel barwić przez około 15 min.
Żel obejrzeć w świetle UV, korzystając z transiluminatora. Jeśli potrzeba (gdy
żel mocno świeci) odbarwić go płucząc w wodzie destylowanej.
Literatura:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory
manual, 2. wyd. CSHLP, Cold Spring Harbor.
31/33
3. Po co są te substancje w roztworach stosowanych podczas
ćwiczeń?
woda – podstawowy rozpuszczalnik stosowany w biologii molekularnej
Tris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) – substancja buforująca,
utrzymuje pH roztworu (7-8)
glicyna (w formie glicyna-HCl) – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu
(2-3)
NaH2PO4 – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu (7-8)
NaCl – substancja zapewniająca siłę jonową roztworu (także ciśnienie
osmotyczne)
SDS – mocny anionowy detergent, upłynniający wszystkie błony komórkowe i
denaturujący białka, nadający im ujemny ładunek wypadkowy
β-merkaptoetanol (β-ME) – substancja redukująca, m.in. mostki dwusiarczkowe
w białkach
ditiotreitol (DTT) – substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe w
białkach
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) – nieodwracalny inhibitor peptydaz
serynowych
EDTA – substancja hamująca nukleazy poprzez wymiareczkowanie z roztworu ich
kofaktorów – kationów dwuwartościowych, np. Mg2+
imidazol – substancja współzawodnicząca z histydyną o miejsca wiążące na NiNTA agarozie
mocznik – substancja lizująca komórki i denaturująca białka
akryloamid (i N,N'-metylenobisakryloamid) – substancje wytwarzające w
wyniku polimeryzacji ze sobą usieciowany poliakryloamid
nadsiarczan amonowy (APS) – przeciwutleniacz używany przy polimeryzacji
akryloamidu
N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED) – katalizator polimeryzacji
akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidu
kwas trójchlorooctowy (TCA) – substancja wytrącająca białka z roztworu, może
przy okazji niestety nieodwracalnie zniszczyć ich aktywność biologiczną
NaOH – substancja do zobojętnienia mocno zakwaszonych próbek przed
elektroforezą
glicerol – substancja obciążająca próbkę do elektroforezy
błękit bromofenolowy – ciemnofioletowy barwnik migrujący do anody w trakcie
SDS-PAGE
błękit Coomassie'go R-250 – barwnik tworzący niebieskie kompleksy z białkami
kwas octowy – substancja do usuwania nadmiaru barwnika po barwieniu białka w
żelu akryloamidowym
etanol – substancja do odpłukiwania TCA z osadu białek
agaroza – substancja wytwarzająca, po utworzeniu na gorąco roztworu i
32/33
ostudzeniu, usieciowany żel
oranż G – pomarańczowy barwnik migrujący do anody w trakcie elektoforezy w
żelu agarozowym
bromek etydyny – barwnik tworzący z DNA kompleksy świecące w UV na
pomarańczowo
IPTG – izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozyd, analog laktozy, induktor ekspresji
genów będących pod kontrolą promotora laktozowego
X-gal – 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd, substrat
β-galaktozydazy, po hydrolizie dający niebieską pochodną indygo
33/33

BIAŁKA i KWASY NUKLEINOWE Uniwersytet Warszawski

Transkrypt

Podobne dokumenty

www.asf

Ostrzeżenie przed afrykańskim pomorem świń w FR

Elektorforeza białek surowicy krwi

Komunikat GIS dotyczący pierwszych przypadków afrykańskiego

Komenda Powiatowa Policji w Będzinie Afrykański pomór świń (ASF

Produkcja świń w Polsce nigdy w historii nie była tak zagrożona z

INFORMACJA TYGODNIOWA Zagrożenia – Skutki

Syngen Milk DNA Mini Kit