WCZESNA DIAGNOSTYKA GRUCZOLAKOWATOŚCI PŁUC OWIEC

WCZESNA DIAGNOSTYKA GRUCZOLAKOWATOŚCI PŁUC
OWIEC
AUTOR: Anna Kycko
PROMOTOR: prof. dr hab. Michał Reichert
RECENZENCI: prof. dr hab. Janusz Madej (UP Wrocław)
prof. dr hab. Jacek Roszkowski (PIWet-PIB).
STRESZCZENIE
Celem pracy było zbadanie możliwości wczesnej (przedśmiertnej) diagnostyki
laboratoryjnej gruczolakowatości płuc owiec.
W pierwszym etapie pracy zbadano
możliwość wykrywania materiału genetycznego wirusa we krwi i wydzielinie dróg
oddechowych chorych owiec. W tym celu zastosowano metody: RT-PCR, PCR,
hemi-nested PCR i real-time PCR do amplifikacji fragmentu regionu LTR retrowirusa
wywołującego chorobę– jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV). Do badań wykorzystano 9
owiec doświadczalnych, z których 5 zakażono dotchawiczo wirusem JSRV w wieku
2 tygodni. Materiał biologiczny do badań pobierany przyżyciowo od tych zwierząt
stanowiła krew i wydzielina dróg oddechowych. Pośmiertnie pobrano do badań wycinki
tkanki płucnej, śledziony, wątroby i śródpiersiowych węzłów chłonnych. Ponadto,
materiał do badań stanowiły: krew i wycinki tkanki płucnej od owiec ze stad krajowych,
próbki DNA izolowanego z krwi owiec z Francji oraz z regionu Bliskiego Wschodu
(ze stad, w których występowała gruczolakowatość płuc owiec), oraz wycinki płuc
zakażonych JSRV owiec z Anglii i Hiszpanii. Wycinki tkanek płuc zostały poddane
badaniu histopatologicznemu na obecność gruczolakoraka płuc owiec. Zastosowano
również badanie immunohistochemiczne w celu wykrycia wirusowej glikoproteiny
powierzchniowej w płucach zakażonych zwierząt. W badaniach zastosowano metodę
elektroforezy dwukierunkowej w celu porównania ekspresji białek w tkance zmienionej
nowotworowo i tkance zdrowej oraz identyfikacji potencjalnych markerów białkowych
gruczolakowatościpłuc owiec. Plamki uwidocznione w żelach wskazujące na wyższą
ekspresję białek w tkance nowotworowej poddawane były analizie metodą
spektrometrii mas celem identyfikacji białek.
Czułość analityczną PCR , hemi-nested PCR i real-time PCR
ustalono na
poziomach odpowiednio: 103, 102 i 102 kopii wirusa. Obecność prowirusowego DNA
i wirusowego RNA stwierdzono w wydzielinie dróg oddechowych pobranej z nosa
zakażonych doświadczalnie zwierząt wykazujących objawy duszności
oraz
we wszystkich wycinkach zmienionej nowotworowo tkanki płucnej zakażonych
zwierząt. Obecność prowirusa stwierdzono również w węzłach chłonnych jednej
z owiec doświadczalnych, jak również w niektórych próbkach DNA izolowanego z krwi
owiec otrzymanych z zagranicy.
Przeprowadzono
badania
sekcyjne
zwierząt
doświadczalnych
oraz
badanie
histopatologiczne wszystkich otrzymanych wycinków tkanek płucnych. Obecność
charakterystycznych zmian nowotworowych stwierdzono
zakażonych doświadczalnie owiec oraz
i
Hiszpanii.
Zastosowanie
metody
w wycinkach pochodzących z Anglii
immunohistochemicznej
przeciwciało skierowane przeciwko wirusowej
i pozwoliło
w płucach wszystkich
wykorzystującej
glikoproteinie powierzchniowej
potwierdzić obecność wirusowego antygenu w tkance płuc zwierząt
zakażonych JSRV. W wyniku badania tkanek metodą elektroforezy dwukierunkowej
w połączeniu z metodą spektrometrii mas zidentyfikowano w sumie 71 polipeptydów
związanych z tymi plamkami w elektroforegramach, które
wskazywały
na
nadekspresję białek w tkankach nowotworowych. Spośród nich 38 białek opisywanych
było według dostępnej literatury jako ulegające nadekspresji w ludzkich komórkach
nowotworowych. Spośród tych białek 10 polipeptydów tj.: cytokeratyny CK8, CK18,
CK19, białko HSP70, hnRNP A2/B1, enolaza 1, kinaza pirogronianowa M2, izomeraza
trójfosforanowa 1, katepsyna H, aldolaza A, opisywane były jako ulegające
nadekspresji w komórkach nowotworowych oraz we krwi ludzi, u których
zdiagnozowano
podobnego
morfologicznie
niedrobnokomórkowego raka płuc.
do
gruczolakoraka
płuc
owiec
SUMMARY
The purpose of the study was
to determine the possibility of the
early
diagnostics of the ovine pulmonary adenocarcinoma (OPA). In the first part of
the study, the application of RT PCR, PCR, hemi-nested PCR and real-time PCR
methods were tested for the possibility of JSRV genome [LTR region] detection
in peripheral blood leukocytes and respiratory tract fluid of OPA affected sheeps.
The experimental group of 9 animals was used for the studies including 5 lambs
infected with jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) by intratracheal inoculation at the age
of two weeks. The samples taken pre mortem included blood and respiratory tract fluid
(collected from infected animals). Lung tissue, mediastinal lymph nodes, spleen and
liver were collected and examined post mortem. The field studies included samples of
blood taken from sheep from Polish flocks and lung tissue samples obtained from
abbatoir, DNA isolated from blood of sheep from French and the Near East located
flocks with history of OPA and frozen lung tissue samples from OPA affected sheep
from England and Spain. Lung tissue samples were histologicaly examined for the
presence of pulmonary adenocarcinoma. Immunohistochemical analysis was performed
additionaly for the detection of JSRV SU – viral superficial glycoprotein. Moreover, the
expression of proteins in tumour and nontumour tissues were compared using two
dimensional electrophoresis (2DE) for the identification of potential protein markers of
OPA. The spots showing higher expression in 2D gels of neoplastic tissues were
submitted to the mass spectrometry analysis for protein identification.
The sensibility of PCR , hemi-nested PCR and real-time PCR was estimated as
3
2
10 , 10 and 102 viral copies respectively. Both proviral DNA and RNA were detected
in the lung fluid taken from JSRV infected sheep showing clinical sings of OPA and
in all neoplastic tissues. Proviral DNA was found in mediastinal lymph node of one
of experimental sheeps. 9 of 15 DNA samples from France and 5 of 66 DNA samples
from the Near East located farms were positive for the presence of JSRV LTR. All the
blood samples and lung tissue samples collected from Polish sheep were negative for
the presence of JSRV LTR. The characteristc neoplastic lesions were found in all lung
tissue sections of experimentaly infected sheep as well as in the sections from OPA
affected sheep from England and Spain. Immunohistochemical analysis revealed
positive reaction for viral superficial glycoprotein observed in neoplastic cells and lung
fluid in lung adenocarcinoma sections. As a result of 2DE and mass spectrometry
analysis, 71 proteins were identified in spots which were overexpressed in 2DE gels
from neoplastic tissues. 38 of the proteins are known to be overexpressed in human
neoplastic tissues, including ten polypeptides overexpressed in human non-small lung
cancer – both in cancer cells and blood: cytokeratines CK8, CK18, CK19, HSP70,
hnRNP A2/B1, enolase 1, pyruvate kinase M2, triphosphate isomerase 1, cathepsin H,
aldolase A.