Nr kat. IR652

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Nucleophosmin
Klon 376
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR652
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Nucleophosmin, klon 376, Ready-to-Use, (Link), jest przeznaczone
do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało umoŜliwia zidentyfikowanie natywnej
nukleofosminy (NPM) i jej zmutowanego odpowiednika NPMc+. Nukleofosmina jest zlokalizowana w jądrach komórek
prawidłowych w róŜnych tkankach — do nieprawidłowej akumulacji nukleofosminy dochodzi w cytoplazmie
białaczkowych komórek blastycznych w duŜej podgrupie przypadków ostrej białaczki szpikowej z prawidłowym
kariotypem (1-3). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania
morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego
patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
B23, NO38, NPM, numatryna, (1).
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Nukleofosmina (NPM) jest fosfoproteiną naleŜącą do rodziny białek nukleoplazmin (1). NPM jest zlokalizowana
głównie w jądrach komórek wielu tkanek (4). Jednak NPM moŜe być transportowana między jądrem komórkowym i
cytoplazmą — transport oraz odpowiednie rozmieszczenie nukleofosminy w regionach komórki ma duŜe znaczenie
dla homeostazy komórki (1). W wielu ludzkich nowotworach złośliwych często dochodzi do nadmiernej ekspresji,
mutacji, delecji oraz zmiany rozmieszczenia genu NPM (NPM1). W zaleŜności od poziomu ekspresji i ilości gen NPM
działa jako onkogen lub wywiera działanie supresorowe. Całkowita utrata funkcji NPM prowadzi do aneuploidii i
aktywacji punktów zwrotnych proliferacji komórek (1).
Mutacje w eksonie 12 genu NPM1 są przyczyną generacji zmutowanego odpowiednika NPM — NPMc, który jest
zlokalizowany (nieprawidłowo) w cytoplazmie białaczkowych komórek blastycznych w duŜej podgrupie przypadków
pierwotnej ostrej białaczki szpikowej (AML) z prawidłowym kariotypem (1 – 4). Obecność NPMc wykazano w wielu
liniach z preparatów AML wszystkich podtypów z wyjątkiem M3 (ostra białaczka promielocytowa), M4eo (ostra
białaczka mielomonocytarna z eozynofilią) i M7 (ostra białaczka megakariocytowa) (2, 4). Prawdopodobne jest, Ŝe
mutacja i akumulacja genu NPMc (NPMc+) jest głównym czynnikiem prowadzącym do białaczki, poniewaŜ moŜe
zakłócać prawidłowe działanie NPM. Obecności NPMc nie stwierdzono w Ŝadnym przypadku pierwotnej białaczki
AML z określoną nieprawidłowością genetyczną, w preparatach z wtórnych białaczek AML ani w nowotworach
układu krwiotwórczego i spoza układu krwiotwórczego innych niŜ AML (2, 4). Obecność NPMc stwierdzono tylko w
pierwotnych białaczkach AML z prawidłowym kariotypem (2, 4, 5).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: 376. Izotyp: IgG1, lambda.
Immunogen
Rekombinowane białko NPM o pełnej długości.
Swoistość
W testach Western blot lizatów komórek U937, lizatów linii komórkowej AML (2) i lizatów komórek OCI-AML3 (3)
przeciwciało barwi prąŜek odpowiadający masie 37 kDa, czyli białku NPM.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
(118966-002)
Dako Denmark A/S
IR652/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link
wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub
2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być
określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie wybarwienia innym
natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision FLEX+ mogą zostać
zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy skontaktować się z
działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest
prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować wątrobę, natomiast
we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej
tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse
(Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciała wykazują zarówno wzór odczynu jądrowego lub cytoplazmatycznego i
jądrowego.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje natywny gen NPM w jądrach komórek jelit, nerek, wątroby, płuc, węzłów
chłonnych, trzustki, gruczołu krokowego, śledziony, grasicy i migdałków. Znakowanie jąder zaobserwowano we
wszystkich komórkach móŜdŜka, a dodatkowo stwierdzono wybarwienie cytoplazmy duŜych neuronów. Hepatocyty
w wątrobie wykazują umiarkowany do silnego odczyn jądrowy, podczas gdy rozproszone komórki mitotyczne i
postmitotyczne wykazują słaby do umiarkowanego odczyn cytoplazmatyczny i jądrowy.
Tkanki patologiczne: Przeciwciało barwiło białka natywne NPM i zmutowane białka NPMc (2, 3) — w rezultacie
uzyskano odczyn jądrowy i cytoplazmatyczny białaczkowych komórek blastycznych w 208/591 preparatów (~35%) z
pierwotnych białaczek AML oraz w 142/230 (~61%) preparatów z pierwotnych białaczek AML z prawidłowym
kariotypem. Natomiast odczyn jądrowy i cytoplazmatyczny w białaczkowych komórkach blastycznych
zaobserwowano tylko w 24/263 (~9%) przypadków AML z nieprawidłowym kariotypem — w Ŝadnym z tych
przypadków nie stwierdzono nieprawidłowości genetycznych często występujących w pierwotnych białaczkach AML.
Samo znakowanie jąder stwierdzono w 135/135 (100%) preparatów wtórnych białaczek AML oraz w 980/980
preparatów z nowotworów układu krwiotwórczego i spoza układu krwiotwórczego innych niŜ AML (2).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
Grisendi S, Mecucci C, Falini B, Pandolfi PP. Nucleophosmin and cancer. Nature Rev Cancer 2006;6:493-505.
Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcaly M, Rosatin R, Pasqualucci L, et al. Cytoplasmic nucleophosmin in acute
myologenous leukemia with a normal karyotype. New Engl J Med 2005;352:254-66.
Falini B, Bolli N, Shan J, Martelli PM, Liso A, Pucciarini A, et al. Both carboxy-terminus NES motif and mutated
tryptophan(s) are crucial for aberrant nuclear export of nucleophosmin leukemic mutants in NPMc+ AML. Blood
2006;107:4514-23.
Falini B, Martelli PM, Bolli N, Bonasso R, Ghia E, Pallotta MT, et al. Immunohistochemistry predicts
nucleophosmin (NPM) mutations in acute myeloid leukemia. Blood 2006;108:1999-2005.
Pasqualucci L, Liso A, Martelli MP, Bolli N, Pacini R, Tabarrinni A, et al. Mutated nucleophosmin detects clonal
multilineage involvement in acute myeloid leukemia: Impact on WHO classification. Blood 2006:108;4146-55
O bjaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
W yrób medy czny do
diagnosty ki in vitro
Zawart ość wys tarcza na <n>
test ów
P roducent
Sprawdzić w instrukcji
st osowania
Numer serii
(118966-002)
Dako Denmark A/S
IR652/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17