Cytogenetyka traw

Księga Polskich Traw
Redakcja: LUDWIK FREY
Instytut Botaniki im. W. Szafera
Polska Akademia Nauk
Kraków, 2007
Cytogenetyka traw
4
ANDRZEJ JOACHIMIAK i ADAM KULA
WSTĘP
Trawy (Poaceae) to jedna z najliczniejszych w gatunki rodzina roślin okrytonasiennych
(FREY 2000). Dzięki swoim szczególnym cechom (MIZIANTY 1995; KELLOGG 2000) i wysokiej produktywności trawy zajmują ok. 20% powierzchni lądów (SHANTZ 1954) i odgrywają decydującą rolę w wyżywieniu ludzkości (KELLOGG 1998; GAUT 2002). Ze względu
na wielkie znaczenie w przyrodzie i gospodarce człowieka stanowią szczególnie ważny
obiekt badań cytogenetycznych, które mają tutaj, obok aspektu poznawczego także doniosły
aspekt praktyczny.
Znaczna część badań cytogenetycznych nad trawami dotyczy ich elementarnych cech
kariologicznych, a więc liczby i wielkości chromosomów. Mimo znaczącego rozwoju bardziej zaawansowanych podejść badawczych, daleko wykraczających poza liczenie i mierzenie chromosomów, dane kariologiczne uważane są do dziś przez większość autorów
za szczególnie istotne dla poznania tej grupy roślin (KELLOGG 1998, 2000; GAUT 2002;
KELLOGG & BENNETZEN 2004).
Wynika to z faktu, iż głównymi mechanizmami trwającej od ponad 60 mln lat ewolucji
traw (BREMER 2002) były poliploidyzacja oraz zmiany ilości DNA w genomie. Najdobitniejszymi i stosunkowo łatwymi do zaobserwowania śladami działania tych mechanizmów
są zmiany liczby i/lub wielkości chromosomów. Uwzględnienie tych cech spowodowało
zasadniczą rewolucję w systematyce traw (AVDULOV 1931). Interesująca problematyka
kariologii traw nie będzie tu jednak poruszana, ponieważ stanowi przedmiot odrębnego
opracowania (MIZIANTY 2007), do której jednak będą pojawiać się nawiązania przy omawianiu innych zagadnień.
110
Księga Polskich Traw
PRZEGLĄD PODSTAWOWYCH
METOD I PODEJŚĆ BADAWCZYCH
STOSOWANYCH W CYTOGENETYCE TRAW
Klasyczna analiza kariotypu
Głównym celem większości badań cytogenetycznych jest analiza kariotypu, czyli opis kompleksu chromosomowego organizmu, uwzględniający morfologię i budowę wewnętrzną poszczególnych chromosomów. Dane dotyczące struktury kariotypu traw mają nieocenione
znaczenie w badaniach podstawowych i znajdują liczne zastosowania praktyczne (głównie
w hodowli). Niezbędne są też do prowadzenia badań porównawczych, mających np. na celu
poznanie przemian ewolucyjnych w obrębie tej grupy roślin.
Analiza kariotypu traw jest trudna, ponieważ ich kompleksy chromosomowe są zazwyczaj słabo zróżnicowane. Chromosomy większości gatunków są przeważnie metacentryczne
(równoramienne) i mają zbliżoną długość, tak więc trudno je od siebie odróżnić. Zazwyczaj jedynymi wyróżniającymi się, a więc łatwymi do zidentyfikowania, są chromosomy
z organizatorami jąderek (NOR-chromosomy, SAT-chromosomy), które u wielu gatunków
poza tym, iż zawierają dodatkowe przewężenie (nie zawsze jednak obserwowane w preparatach), mogą być różnoramienne. Powoduje to bardzo poważne trudności w odróżnieniu
chromosomów nawet u diploidów, posiadających stosunkowo niewiele chromosomów.
U poliploidów, posiadających znaczną liczbę podobnych chromosomów (Ryc. 1), dokładna
analiza kariotypu na podstawie ich morfologii jest praktycznie niewykonalna. Dodatkowym
utrudnieniem w analizie kariotypu większości gatunków traw (szczególnie należących do
podrodzin Bambusoideae, Chloridoideae i Panicoideae) są niewielkie rozmiary chromosomów. Jedynie u przedstawicieli podrodziny Pooideae chromosomy osiągają stosunkowo
duże rozmiary (MIZIANTY 1995).
Ryc. 1. Chromosomy Bromus arizonicus (2n=12x=84) barwione orceiną octową. Wyraźny brak zróżnicowania chromosomów, zarówno pod względem ich długości, jak i położenia centromerów (Joachimiak i in., niepublikowane)
Fig. 1. Chromosomes of Bromus arizonicus (2n=12x=84) stained in acetic orceine. Visible lack of chromosome differentiation, with respect to both their length and location of centromeres (Joachimiak et al., unpbl.)
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
111
Dość pomocne w analizie kariotypu traw mogą być dokładne pomiary całkowitej długości chromosomów oraz długości ich poszczególnych ramion (co umożliwia ustalenie
pozycji centromeru – indeks centromerowy, bądź stosunek ramion). Zabiegi te umożliwiają przynajmniej ogólną (opartą na statystyce) charakterystykę danego kariotypu, nie
ułatwiają jednak wcale identyfikacji poszczególnych chromosomów w konkretnych płytkach metafazowych. Najczęściej więc tam, gdzie niezawodna identyfikacja poszczególnych
chromosomów w konkretnym preparacie jest istotna, klasyczna analiza kariotypu okazuje
się niewystarczająca. Trudności tego typu nie są aż tak powszechne w analizie kariotypu
przedstawicieli wielu innych grup roślin, a także zwierząt, ponieważ wielu z nich posiada
bardziej zróżnicowane kariotypy.
Wymienione wyżej cechy chromosomów traw spowodowały, że przez stosunkowo długi
okres czasu (mniej więcej do połowy lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku) badania kariotypu traw nie były ani tak szczegółowe, ani tak zaawansowane jak badania kariotypu
niektórych innych grup organizmów, szczególnie ssaków. Istnienie nieprzekraczalnych
barier metodycznych powodowało, iż badacze zajmujący się cytogenetyką tej grupy roślin
skupiali się raczej na analizie liczby i wielkości chromosomów, a w badaniach porównawczych starali się wykorzystywać raczej uogólnione, statystycznie uchwytne cechy budowy
kompleksów chromosomowych, takie jak np. współczynniki asymetrii kariotypu (krytyczny
przegląd zagadnień dotyczących współczynników asymetrii: PASZKO 2006). Miało to także
swoje dobre strony – skupienie uwagi na analizie liczb chromosomów spowodowało, iż już
pod koniec lat sześćdziesiątych rodzina traw była jedną z najlepiej poznanych pod względem kariologicznym (BOLKHOVSKIKH 1969).
Analiza przebiegu mejozy
Jednym z najważniejszych kierunków wcześniejszych badań cytogenetycznych była analiza
mejozy, prowadzona głównie pod kątem przebiegu koniugacji chromosomów i ich późniejszego rozdziału do komórek potomnych. Dostarczyła ona wielu informacji ogólnych na
temat budowy genomów poszczególnych gatunków, w szczególności zaś ich pokrewieństwa
(STEBBINS 1950; STACE 1993; ROGALSKA i in. 1999). Warto zauważyć, iż analiza przebiegu
koniugacji chromosomów w mejozie stanowi historycznie najwcześniejszą formę genomiki
porównawczej, znacznie poprzedzającą w czasie pojawienie się jej współczesnej wersji, opartej głównie na badaniach sekwencji DNA. Przez kilkadziesiąt lat stanowiła główne, z pewnością najistotniejsze źródło wiedzy na temat pokrewieństwa genomów traw i innych roślin.
Oparte na analizie mejozy badania porównawcze prowadzone być mogą jedynie pod warunkiem, że porównywane genomy/chromosomy współwystępują w komórce przechodzącej mejozę. Warunek ten może być spełniony w przypadku eksperymentalnie otrzymanego
mieszańca lub formy mieszańcowej powstałej w naturze (np. naturalnego allopoliploida).
W tym ostatnim przypadku powinien to być poliploid stosunkowo niedawno powstały,
ponieważ różnice pomiędzy genomami współwystępującymi u allopoliploidów stopniowo
ulegają zatarciu na skutek zachodzenia słabo jeszcze poznanych procesów, noszących
zbiorczą nazwę wtórnej diploidyzacji. U bardzo starych poliploidów (paleopoliploidów) doprowadzają one do tak daleko posuniętych zmian, iż stają się cytologicznie nieodróżnialne
112
Księga Polskich Traw
od diploidów (ich poliploidalny status jest niemożliwy do ustalenia na podstawie analizy
cytogenetycznej).
Ponieważ u traw stosunkowo łatwo można otrzymać mieszańce (nawet międzyrodzajowe) na drodze eksperymentalnej, ponadto zaś znaczna część spośród nich to naturalnie
powstałe allopoliploidy, stanowią one wyjątkowo dobry obiekt tego typu badań. Liczbę
rozpoznanych naturalnych mieszańców międzygatunkowych szacuje się u nich na około
2000, a mieszańców międzyrodzajowych na ok. 800 (FREY 2000). Liczbę allopoliploidów
trudno ocenić, ale stanowią one znaczą część naturalnie powstałych poliploidów, których
jest wśród traw wyjątkowo wiele (według ostrożnych szacunków, ok. 40% – DEWET 1986).
Nic więc dziwnego, że analiza koniugacji chromosomów u mieszańców stanowi jeden
z podstawowych działów cytogenetyki traw. Wśród badań szczególnie ważnych, inicjujących tego typu podejście wymienić należy prace jednego ze współtwórców syntetycznej
teorii ewolucji, L. Stebbinsa nad mieszańcami z amerykańskiej sekcji Ceratochloa w obrębie rodzaju Bromus (STEBBINS i in. 1944; STEBBINS 1947) oraz prace badaczy szwedzkich,
MÜNTZINGA (1935) i NORDENSKIÖLD (1945) nad Phleum.
Badania tego typu prowadzone były nadzwyczaj często przez badaczy zajmujących
się zbożami, szczególnie pszenicą, jęczmieniem i żytem, zarówno hodowców, jak i tych,
którzy zajmowali się pochodzeniem i ewolucją kompleksów chromosomowych w obrębie
rodzaju Triticum, Hordeum oraz Secale. Miały one niezwykle istotne znaczenie zarówno
praktyczne, jak i teoretyczne i prowadzone są także dzisiaj, najczęściej w połączeniu z innymi, bardziej nowoczesnymi metodami (przegląd: MOORE 2000). Doprowadziły one między
innymi do poznania składu genomowego i pochodzenia heksaploidalnej pszenicy (Ryc. 2)
oraz wzajemnych relacji pomiędzy genomami najbliżej z nią spokrewnionych gatunków
diploidalnych (Aegilops, Triticum), a także ich licznych dziko rosnących i uprawianych
mieszańców (SEARS 1954; FELDMAN i in. 1995).
Jednym z bardziej wyszukanych podejść na tej drodze jest analiza mejozy u sztucznie
bądź naturalnie powstałych roślin, wykazujących obniżoną w stosunku do badanych, wyjściowych poliploidów liczbę genomów (na przykład haploidów AB otrzymanych w potomstwie roślin tetraploidalnych AABB) (NORDENSKIÖLD 1941; YANG i in. 1999; JAUHAR
2006). Umożliwia ona rozpoznanie zachowania różnych genomów danego poliploida w sytuacji braku genomów do nich homologicznych. Sytuacja taka pozwala na lepszą ocenę
pokrewieństwa tych genomów, ponieważ wyklucza możliwość blokowania koniugacji
homeologicznej wskutek preferencyjnego łączenia się genomów/chromosomów o ścisłej
homologii. W tym kontekście warto tu wspomnieć o pionierskich badaniach MCCLINTOCK
(1933) nad mejozą u haploidalnej kukurydzy, które zawierały pierwszą w historii sugestię,
iż gatunek ten, uważany do niedawna za typowego diploida (2n=2x=20, a więc x = 10)
może mieć tetraploidalne pochodzenie. Autorka ta stwierdziła, że chromosomy haploidalnej
kukurydzy (n = 10) wykazują zdolność koniugowania ze sobą i tworzenia biwalentów, co
sugerowało iż liczba podstawowa chromosomów kukurydzy wynosi x = 5, a nie x = 10
jak powszechnie sądzono. Przypuszczenie to znajdowało poparcie w niektórych późniejszych badaniach cytogenetycznych (przegląd: MOLINA & NARANJO 1987), jednak w pełni
potwierdzone zostało dopiero w porównawczych badaniach molekularnych genomów zbóż
(przegląd: MOORE 2000).
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
113
Ryc. 2. Schemat przedstawiający pochodzenie heksaploidalnej pszenicy Triticum aestivum (2n=6x=42), która powstała na skutek skrzyżowania tetraploidalnej pszenicy T. turgidum (2n=4x=28) z diploidalnym gatunkiem Aegilops
tauschii (2n=2x=14) i podwojenia chromosomów. T. turgidum powstało na drodze hybrydyzacji dwóch diploidalnych
gatunków – T. urartu oraz formy blisko spokrewnionej z dzisiejszym Ae. speltoides i podwojenia chromosomów
(FELDMAN i in. 1997)
Fig. 2. Diagram showing the origin of the hexaploid wheat Triticum aestivum (2n=6x=42) as a result of crossing the
tetraploid wheat T. turgidum (2n=4x=28) with the diploid species Aegilops tauschii (2n=2x=14) and chromosome duplication. T. turgidum originated as a result of hybridization of two diploid species – T. urartu and a form closely related
to the present Ae. speltoides and chromosome duplication (FELDMAN et al. 1997)
Badania mejozy u mieszańców opierają się na założeniu, że koniugacja genomów (a w zasadzie budujących je chromosomów) zależy od ich podobieństwa (pokrewieństwa): genomy
homologiczne (identyczne) wykazują całkowitą koniugację, genomy homeologiczne (zbliżone budową) koniugują częściowo, zaś genomy znacznie różniące się (niespokrewnione)
nie wykazują zdolności koniugacji. Zgodnie z tym założeniem, u autopoliploidów posiadających identyczne genomy (np. AAAA) tworzone powinny być w mejozie poliwalenty
(triwalenty w przypadku triploidów, tetrawalenty w przypadku tetraploidów, itd.), u allopoliploidów posiadających po dwa różne genomy (np. AABB) biwalenty, a u allopoliploidów
posiadających genomy homeologiczne (np. A1A1A2A2) biwalenty i poliwalenty w różnych
proporcjach (zależnych od stopnia podobieństwa genomów/chromosomów). Dziesiątki lat
badań nad mejozą wykazały jednak, że sposób koniugacji chromosomów u poliploidów
może znacznie odbiegać od przedstawionego wyżej wzoru (RAMSEY & SCHEMSKE 2002).
Porównanie przebiegu mejozy u nowo powstałych auto- i allopoliploidów wskazuje wyraźnie na to, że różnice między nimi są pod tym względem zaskakująco niewielkie (Ryc. 3).
Sugeruje to, iż wnioskowanie o stopniu pokrewieństwa genomów jedynie na podstawie
koniugacji chromosomów w mejozie może być obarczone znacznym błędem.
114
Księga Polskich Traw
Ryc. 3. Średni procent uniwalentów, biwalentów, triwalentów i tetrawalentów w metafazie pierwszego podziału mejotycznego u nowo powstałych autopoliploidów (N=93) i allopoliploidów (N=78) (RAMSEY & SCHEMSKE 2002)
Fig. 3. Average percentage of univalents, bivalents, trivalents and tetravalents at the metaphase of the first meiotic division in newly formed autopolyploids (N=93) and allopolyploids (N=78) (RAMSEY & SCHEMSKE 2002)
Z problemem koniugacji chromosomów w mejozie wiąże się frapujące odkrycie, że
istnieją czynniki genetyczne, kontrolujące formowanie biwalentów i prawidłowy przebieg
mejozy u form allopoliploidalnych, zawierających w swoim kompleksie zarówno genomy
homologiczne, jak i homeologiczne. Należy do nich tzw. locus Ph1, odkryty po raz pierwszy
u heksaploidalnej pszenicy przez OKAMOTO (1957), którego występowanie w chromosomie
5B u tego gatunku potwierdzone zostało przez RILEY i CHAPMAN (1958). Obecność tego
rodzaju czynników odkryto także u innych poliploidów, np. Avena (RAJHATHY & THOMAS
1972). Promują one koniugację homologiczną w sytuacji, gdy w kariotypie występują zarówno genomy homologiczne, jak i homeologiczne. „Wymuszają” w nieznany nam sposób
formowanie prawie wyłącznie biwalentów, a co za tym idzie niezaburzony przebieg mejozy. To właśnie dzięki czynnikowi Ph1, u heksaploidalnej pszenicy homeologiczne genomy
A, B i D segregują niezależnie od siebie. Stwierdzono, że utrata locus Ph1 na skutek delecji części chromosomu 5B pociąga za sobą automatycznie zaburzenia koniugacji i spadek
płodności, spowodowane tworzeniem asocjacji mejotycznych pomiędzy chromosomami
należącymi do różnych genomów. Badania porównawcze sugerują, iż locus Ph1 nie występował u diploidalnych przodków pszenicy. Pojawił się dopiero u allopoliploidalnego
mieszańca i utrwalił wskutek presji selekcyjnej popierającej regularny przebieg mejozy,
zapewniający mu wysoką płodność (MOORE 2000). Ponieważ występuje on już u Triticum
turgidum (AABB) (JAUHAR 2006), można wiązać jego pojawienie się z powstaniem tego
ustabilizowanego mieszańca, co wydarzyło się przypuszczalnie około pół miliona lat temu
(HUANG i in. 2002).
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
115
Prążkowa analiza chromosomów
Z początkiem lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku opracowano nowe metody barwienia
chromosomów, umożliwiające ujawnienie ich wewnętrznego zróżnicowania – tzw. metody
prążkowe. Pozwalały one na różnicowe barwienie różnych części ramion chromosomowych,
w obrębie których stwierdzano występowanie jaśniej i ciemniej zabarwionych segmentów
(prążków). Już w pierwszej połowie lat siedemdziesiątych XX w. rozwinięto szereg takich
metod, specyficznych dla segmentów chromatyny wykazujących określoną budowę molekularną (przegląd: JOACHIMIAK 1983a). Pojawiła się więc nadzieja, iż metody te nie tylko
umożliwią pełniejszy wgląd w strukturę chromosomów, ale i dokładniejszy opis poszczególnych chromosomów, umożliwiający ich łatwą identyfikację w kariotypie. Nadzieję tę
można, generalnie rzecz biorąc, uznać za spełnioną, jeśli chodzi o badania kariotypu zwierząt, w szczególności zaś ssaków (z człowiekiem włącznie). Okazało się jednak, że najprzydatniejsze w analizie kariotypu metody prążkowe (prążki G i R), które zrewolucjonizowały
cytogenetykę zwierząt, nie znalazły zastosowania w badaniach chromosomów roślinnych
(przegląd: JOACHIMIAK 1983a; JOACHIMIAK i in. 1997). Spośród całego wachlarza metod
prążkowych tylko jedna z nich – metoda prążków C – znalazła naprawdę szerokie zastosowanie w cytogenetyce traw. Metoda ta, umożliwiająca barwienie heterochromatyny, wiele
wniosła do poznania ogólnej budowy genomu (przegląd: JOACHIMIAK 1983b), nie ułatwiła
jednak zbytnio (poza nielicznymi wyjątkami) identyfikacji poszczególnych chromosomów
budujących kompleksy chromosomowe traw. Stwierdzono, iż podobnie jak wiele innych
roślin, wykazują one na ogół słabe zróżnicowanie poszczególnych chromosomów kompleksu pod względem lokalizacji prążków C (Ryc. 4). Jedynie u gatunków o największych
Ryc. 4. Chromosomy Bromus carinatus (2n=8x=56) barwione metodą prążków C (Joachimiak i in., niepublikowane)
Fig. 4. C-banded chromosomes of Bromus carinatus (2n=8x=56) (Joachimiak et al., unpbl.)
116
Księga Polskich Traw
Ryc. 5. Dystrybucja heterochromatyny w kariotypach trzech tetraploidalnych (2n=4x=28) form Phleum: P. commutatum, P. pratense oraz dwóch eksperymentalnych mieszańców (pokolenie F2) pomiędzy nimi. A – P. commutatum
× P. pratense, B – P. pratense × P. commutatum, które upodobniły się pod względem rozkładu heterochromatyny do
jednego z rodziców – P. pratense (KULA i in. 2007)
Fig. 5. Heterochromatin distribution in karyotypes of three tetraploid (2n=4x=28) forms of Phleum: P. commutatum, P. pratense and two experimental hybrids (F2 generation) between them. A – P. commutatum × P. pratense,
B – P. pratense × P. commutatum, which became similar to one of the parents – P. pratense – with respect to heterochromatin distribution (KULA et al. 2007)
genomach, szczególnie bogatych w heterochromatynę (do których należą np. przedstawiciele kompleksu Aegilops-Triticum, Hordeum, Avena i Secale) lokalizacja prążków C jest
na tyle urozmaicona, że umożliwia identyfikację znacznej części, a w niektórych przypadkach nawet wszystkich chromosomów kompleksu (GILL 1981; LINDE-LAURSEN i in. 1990;
JELLEN i in. 1993; ROGALSKA i in. 2002). Szczęśliwym zbiegiem okoliczności, do traw tych
należą prawie wszystkie najważniejsze dla zachodniej cywilizacji zboża, tak więc barwienie heterochromatyny okazało się metodą niezwykle przydatną i często wykorzystywaną
w hodowli zbóż. Znalazła ona też pewne zastosowanie w badaniach porównawczych innych
traw, bowiem stwierdzono, że niektóre blisko spokrewnione gatunki mogą różnić się pod
względem ilości i lokalizacji heterochromatyny w genomie. Przykładem mogą być tu niektóre gatunki Aegilops (GILL 1981), Phleum (JOACHIMIAK & KULA 1993, 1996; JOACHIMIAK
2005; KULA 2005) oraz Bromus (TUNA i in. 2001, 2005, 2006).
Istnienie takich różnic zrodziło nadzieję, iż okażą się one przydatne w analizie kompleksów chromosomowych allopoliploidów. Sądzono, iż genomy rodzicielskie, wykazujące różną
dystrybucję heterochromatyny, będą łatwo rozpoznawalne u mieszańca. Niestety, w większości przypadków formy rodzicielskie nie wykazywały wystarczających różnic pod tym
względem. Inną przeszkodą okazała się duża zmienność heterochromatyny u mieszańców
oraz procesy prowadzące do ujednolicenia jej dystrybucji we współwystępujących u allo-
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
117
Ryc. 6. Chromosomy heksaploidalnego Triticale (2n=6x=42) barwione metodą prążków C. Kariotyp tego mieszańca
zawiera cztery genomy pszenicy i dwa genomy żyta. Chromosomy żyta można rozpoznać dzięki dużym blokom heterochromatyny telomerycznej. Chromosomy pszenicy posiadają głównie heterochromatynę przycentromerową (SOBIESZCZAŃSKA 2000)
Fig. 6. C-banded chromosomes of the hexaploid Triticale (2n=6x=42). The karyotype of this hybrid contains four genomes of wheat and two genomes of rye. Chromosomes of rye can be distinguished thanks to large blocks of telomeric
heterochromatin. Chromosomes of wheat possess mainly pericentromeric heterochromatin (SOBIESZCZAŃSKA 2000)
poliploidów genomach. Dobrym przykładem mogą być tutaj eksperymentalne tetraploidalne
mieszańce Phleum pratense i P. commutatum (KULA i in. 2007). Pomimo iż genomy form
rodzicielskich znacznie różniły się dystrybucją heterochromatyny, chromosomy mieszańców
wykazywały jednorodny jej rozkład, podobny do tego, który występuje u jednego z rodziców
(Ryc. 5). Jednym z nielicznych, niezwykle interesujących wyjątków pod tym względem jest
Triticale, syntetyczny mieszaniec pomiędzy pszenicą i żytem (ROGALSKA 1977). U rośliny
tej obserwuje się wprawdzie dość dużą zmienność pod względem ilości heterochromatyny
(PILCH 1981; przegląd: ROGALSKA 2005), ale charakterystyczne różnice w jej rozkładzie
pomiędzy genomami rodzicielskimi nie uległy zatarciu (Ryc. 6). Możliwość identyfikacji
chromosomów żyta i pszenicy u tego mieszańca ma duże znaczenie w hodowli.
Nowe metody badań – nowe problemy
Lata osiemdziesiąte i dziewięćdziesiąte ubiegłego wieku przyniosły burzliwy rozwój porównawczych badań genomu roślinnego, prowadzonych w oparciu o pomiary ilości DNA
w cytometrze przepływowym oraz metody molekularne (przegląd: MAŁUSZYŃSKA 1999).
Obiektem wielu z nich były trawy, tak więc nasza wiedza na temat tej grupy roślin uległa
w tym czasie znacznemu poszerzeniu. Metody molekularne, oparte głównie na hybrydyzacji kwasów nukleinowych in situ oraz pomiary ilości DNA w jądrach komórkowych i chro-
118
Księga Polskich Traw
mosomach stały się częścią nowej gałęzi cytogenetyki – cytogenetyki molekularnej. Włącza
ona dziś do swego warsztatu szereg dalszych metod, ułatwiających badanie chromosomów,
np. immunolokalizację określonych białek lub sekwencji DNA, analizę restrykcyjną, czy
też mikromanipulację. Dzisiejsza cytogenetyka wykorzystuje poza tym w szerokim zakresie
wszelkie inne przydatne dla niej dane, głównie uzyskane przez genetykę molekularną, co
powoduje iż granice pomiędzy tymi dziedzinami uległy zatarciu.
Pomiary ilości jądrowego DNA wykazały, że rodzina traw jest pod tym względem bardzo
zróżnicowana: maksymalna stwierdzona różnica w ilości 2C DNA jest tu ponad stukrotna
(0,50 pg – 51,95 pg), jeśli uwzględnimy w zestawieniu oktoploidalne Triticale, które ma
największą notowaną do tej pory wśród traw wartość 2C DNA (Angiosperm C-value Database: http://www.rbgkew.org.uk./cval/). Po części za tak wielkie różnice odpowiada poliploidalność, ponieważ formy wysoko poliploidalne posiadają wyraźnie więcej jądrowego
DNA niż ich diploidalni krewni. Z drugiej strony, jeśli weźmiemy pod uwagę całą rodzinę
traw, związek pomiędzy ilością jądrowego DNA a liczbą chromosomów jest niewielki – gatunki o małej liczbie chromosomów mogą mieć znacznie więcej DNA niż gatunki o dużej
liczbie chromosomów (GAUT 2002). Wskazuje to wyraźnie, że różnice w ilości DNA stanowią nie tylko wyraz przemian poliploidalnych, ale i naturalnego zróżnicowania wielkości
podstawowych, monoploidalnych (x) genomów traw. Najmniejszy pojedynczy genom ma
Oropetium thomaceum (0,25 pg), największy zaś Psathyrostachys fragilis (8,40 pg), różnica
w wielkości genomu tych roślin jest więc ponad trzydziestokrotna (33,6). Niektóre ważne
dla nas trawy mają genomy zbliżone wielkością do tych skrajnych wartości: Oryza sativa
– 0,5 pg, Triticum aestivum – 5,8 pg, Secale cereale – 7,8 pg. Stwierdzono, że przyczyną
tak znacznych różnic w ilości DNA przypadającej na genom są głównie wahania w ilości
niekodującego DNA, w szczególności zaś sekwencji powtórkowych, których znaczną część
stanowią retrotranspozony (BENNETZEN 2000a, b; GAUT 2002; KELLOGG & BENNETZEN
2004). Różne typy sekwencji powtórkowych wykazują specyfikę w stosunku do różnych
miejsc w chromosomach traw – np. tandemowe powtórki tworzą najczęściej duże skupienia w heterochromatynie, w okolicach centromerów, retrotranspozony zaś występują raczej
w rozproszeniu, pomiędzy genami, w obrębie ramion chromosomowych (VICIENT i in. 2001).
W obrębie niektórych segmentów chromosomowych, takich jak rDNA, sekwencji retrotranspozonowych w ogóle się nie spotyka, w obrębie innych częstość ich występowania jest
znacznie niższa od średniej dla danego genomu. Na przykład centromery pozbawione są
wielu klas retrotranspozonów powszechnie występujących w innych rejonach chromosomów
(np. sekwencji typu Ty1/copia), ale mogą być wzbogacone w inne, charakterystyczne dla
nich elementy (retroelementy typu Ty3/gypsy) (MILLER i in. 1998).
Ponieważ molekularne mechanizmy retrotranspozycji, a więc amplifikacji transpozonów
są dobrze rozpoznane, natomiast niewiele wiadomo na temat ich eliminacji, BENNETZEN
i KELLOGG (1997) wysunęli interesującą (ale i mocno kontrowersyjną) hipotezę, mówiącą
iż zmiany ilości DNA w genomie mają charakter jednokierunkowy, tzn. że ilość DNA
może w trakcie ewolucji jedynie wzrastać (istotę tej hipotezy najlepiej oddaje określenie
samych autorów – “one-way ticket to genomic obesity”). Podobnie, według innych autorów
(MEYERS & LEVIN 2006), rzecz się ma ze stopniem ploidalności – może się tylko zwiększać.
Wymienione wyżej hipotezy prowadzić mogą do wniosku, iż organizmy o najmniejszej
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
119
ilości DNA w obrębie danej grupy taksonomicznej są najbliższe formie wyjściowej dla tej
grupy (mają najbardziej pierwotny genom jądrowy). Przypuszczenie to, choć podzielane
przez część badaczy, szczególnie zaś tych, którzy zajmują się molekularną genomiką porównawczą, wydaje się co najmniej ryzykowne. To, że mechanizmy prowadzące do zmniejszenia ilości DNA są słabo poznane, nie świadczy wcale, że nie istnieją. Przykładem może
być redukcja ilości DNA u allopoliploidów.
Porównawcze badania ilości jądrowego DNA u diploidów i wywodzących się od nich
allopoliploidów wykazały, że ilość DNA u tych ostatnich nie stanowi zazwyczaj prostej
sumy ilości DNA w genomach rodzicielskich, jak można by się było tego spodziewać.
Nieaddytywne zmiany w ilości DNA u poliploidów prowadzą do spadku bądź, znacznie
rzadziej, do wzrostu ilości DNA w genomie (OHRI 1998; LEITCH & BENNETT 2004). O ile
mechanizmy wzrostu ilości DNA w genomie są, jak już wspomniano, dość dobrze poznane,
o tyle mechanizmy redukujące ilość DNA pozostają wciąż niejasne. Badając syntetyczne
allopoliploidy pszenicy wykazano jednak, że redukcja ilości DNA nie jest procesem stopniowym, wynikającym z działania doboru naturalnego przez szereg pokoleń. Obserwuje
się ją bowiem już w pierwszym pokoleniu mieszańców (OZKAN i in. 2003). Stwierdzono
ponadto, że eliminacja konkretnych sekwencji jest nieprzypadkowa (bo powtarzalna w kolejnych eksperymentach) i dotyczyć może zarówno sekwencji kodujących, jak i niekodujących (FELDMAN i in. 1997; OZKAN i in. 2001; SALINA i in. 2004). Generalną przyczyną
eliminacji DNA u allopoliploidów mógłby być brak dopasowania genomów rodzicielskich,
które po bardzo długim okresie niezależnej ewolucji znalazły się w obrębie jednego jądra.
Powoduje to „szok genomowy” (MCCLINTOCK 1984), którego rozwiązaniem jest szybkie
dopasowanie genomów poliploida, polegające na eliminacji sekwencji, które w jakiś sposób
kolidują ze sobą lub są po prostu nadmiarowe (COMAI i in. 2003).
Metody cytometryczne mogą nie tylko dostarczać danych na temat ilości jądrowego
DNA. Dzięki cytometrii przepływowej możliwa jest analiza cytometryczna kariotypu
(uwzględniająca identyfikację chromosomów po ilości DNA), a także sortowanie chromosomów w zależności od zawartości DNA. Ta ostatnia technika staje się bardzo ważna dla
genetyki, ponieważ z posortowanych chromosomów można wyizolować DNA, co znacznie
ułatwia tworzenie bibliotek genomowych i umożliwia konstruowanie chromosomowo-specyficznych sond molekularnych (stosowanych np. w metodzie FISH). Jeśli chodzi o trawy,
to metody te, podobnie jak i inne wzmiankowane wcześniej, napotykają na trudności spowodowane słabym zróżnicowaniem kariotypu tych organizmów. Chromosomy o zbliżonej
długości, występujące w obrębie danego kompleksu, zawierają także zbliżoną ilość DNA,
co powoduje iż są cytometrycznie nieodróżnialne. Tylko chromosomy wyraźnie odbiegające
wielkością od pozostałych mogą być rozpoznane po ilości DNA i ewentualnie wychwycone
przez urządzenie sortujące. Typowym przykładem mogą być tu chromosomy Hordeum vulgare (2n=2x=14). Spośród siedmiu typów chromosomów występujących w genomie tego
gatunku tylko najmniejszy z nich (1H), może być wychwycony przez urządzenie sortujące i oddzielony od pozostałych (LYSAK i in. 1999). Skutecznie można jednak za pomocą
sortowania wychwytywać chromosomy silnie zmienione (zmutowane), na przykład jednoramienne (SUCHANKOVA i in. 2006). Może to mieć znaczenie praktyczne, ponieważ linie
zawierające takie chromosomy (linie ditelosomiczne) odgrywają dużą rolę w hodowli.
120
Księga Polskich Traw
Badacze zadają sobie czasem wiele trudu, by wyizolować na drodze sortowania chromosomy niektórych traw, mimo braku większych różnic w ilości DNA pomiędzy nimi.
Na przykład każdy z typów chromosomów u żyta wyizolowano na drodze sortowania
wykorzystując odrębne linie addycyjne pszenicy, z których każda zawierała inny dodany
chromosom żyta. Ponieważ chromosomy żyta zawierają znacznie więcej DNA niż chromosomy pszenicy, ich wysortowanie nie nastręcza w tym układzie już większych trudności
(KUBALAKOVA i in. 2003).
Szereg badań molekularnych wykazało, że kodujące geny tworzą w chromosomach traw
stosunkowo nieliczne skupienia, poprzedzielane mniejszą lub większą ilością sekwencji
niekodujących (mniejszą u gatunków o mniejszych genomach, większą u gatunków o większych genomach) (SANDHU & GILL 2002). Geny występujące w każdym z takich skupień
(bloków) wykazują względnie stałe ułożenie, co powoduje, że genomy traw, choć znacznie
różniące się wielkością, można uznać za podobne do siebie. Od pewnego czasu sugerowano więc, że wszystkie trawy reprezentują jeden spójny, genetyczny system (BENNETZEN
& FREELING 1993). Założono, że ich genomy składają się z podobnych bloków genowych,
tyle że różnie zestawionych i leżących w różnej odległości od siebie, czasem zwielokrotnionych (MOORE i in. 1995; DEVOS & GALE 2000). Występowanie stałych, różnie zestawianych
elementów nasunęło nawet jednemu z autorów tej hipotezy skojarzenie z klockami lego
(‘Lego’ genomes – MOORE 1995). Zachowana w ewolucji kolinearność genów nosi miano
syntenii. Jej występowanie stwierdza się także u innych grup organizmów, np. przedstawicieli rodziny Brassicaceae u roślin, czy też u ssaków. Ostatnie badania wskazują jednak,
że wśród traw istnieje wiele mniejszych bądź większych odstępstw od kolinearności genów
i bloków genowych, wywołanych rekombinacjami, delecjami, translokacjami i wieloma
innymi procesami (GAUT 2002). Tak więc hipotezę jednolitego systemu genetycznego,
występującego u wszystkich traw, bardzo pociągającą z teoretycznego punktu widzenia,
należy traktować z rezerwą. Z całą pewnością dogłębne badania tylko jednego, modelowego genomu (jest nim, jak wiadomo, genom ryżu – DEVOS & GALE 2000) nie dadzą nam
więc zadowalającego wyobrażenia na temat struktury genomu wszystkich pozostałych
traw, jak sądzono do niedawna (GALE i in. 1996). Z tego też powodu czynione są ostatnio
starania w celu znalezienia innych obiektów, które mogłyby stać się modelowymi w tego
typu badaniach. Wiele wskazuje na to, że obiektem takim może stać się Brachypodium
distachyon, gatunek ewolucyjnie bliższy nie tylko ważnym dla nas zbożom, takim jak
Triticum, Hordeum, Secale i Avena, ale i wielu innym użytkowym trawom (Poa, Festuca,
Lolium, Bromus), uprawianym w rejonach o umiarkowanym klimacie (DRAPER i in. 2001).
Gatunek ten posiada, w odróżnieniu od ryżu, mniejszą liczbę dobrze odróżnialnych od
siebie chromosomów i dlatego szczególnie dobrze nadaje się do badań cytogenetycznych
(JENKINS i in. 2003; HASTEROK i in. 2004). Ułatwią one między innymi w znacznym stopniu
fizyczne mapowanie genów i innych sekwencji, dostarczą także cennych danych do badań
porównawczych.
Istnieją dwie metody hybrydyzacji in situ (wykonywanej na chromosomach bądź chromatynie, bezpośrednio w preparacie cytologicznym), stosowane w cytogenetyce traw: FISH
(fluorescent in situ hybridization) oraz GISH (genomic in situ hybridization). Pierwsza
z nich polega na hybrydyzacji in situ z sondami reprezentującymi drobne fragmenty geno-
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
121
mu, zwykle jakieś sekwencje powtarzalne, druga zaś na hybrydyzacji z genomowym DNA,
wyizolowanym zazwyczaj z innego gatunku. Zastosowanie FISH w analizie kariotypu traw,
szczególnie poliploidalnych, jest jak do tej pory ograniczone. Przyczyny tego ograniczenia
są podobne jak w przypadku innych, tradycyjnych metod. Genomy traw są mało zróżnicowane, ponadto zaś u poliploidów dochodzi do znacznej ich przebudowy (LI & ZHANG 2002;
KOTSERUBA i in. 2003), co uniemożliwia bądź znacznie utrudnia identyfikację genomów
rodzicielskich. Dodatkową przyczyną trudności jest to, że obecnie metodę FISH stosuje się
na większą skalę jedynie z użyciem kilku uniwersalnych sond na powszechnie występujące
sekwencje powtarzalne: 45S rDNA, 5S rDNA oraz sekwencje telomeryczne typu Arabidopsis (TTTAGGG). Umożliwia to identyfikację tylko niektórych chromosomów kompleksu
(sondy na rDNA), lub powoduje jednolite wyznakowanie wszystkich chromosomów na
ich końcach (sondy na telomery). Ponieważ SAT chromosomy, zawierające 45S rDNA są
stosunkowo łatwo rozpoznawalne także przy użyciu tradycyjnych metod barwienia, istotną
korzyść przynosi tylko sondowanie genomów na obecność 5S rDNA. Niestety, liczba loci
5S rDNA w genomie traw jest mocno ograniczona (najczęściej 5S rDNA występuje w jednej parze chromosomów).
Pewną nadzieję na przełamanie tego impasu tworzy metoda FISH z użyciem mniej standardowych sond, na przykład na przypadkowo wybrane sekwencje mikrosatelitarne (SSRs)
(CUADRADO & JOUVE 2002; SCHWARZACHER 2003; DOU i in. 2006; PRIETO i in. 2006). Metoda ta jest bardzo czuła, umożliwia łatwą identyfikację chromosomów homologicznych,
ponieważ daje sygnały w wielu loci chromosomowych, a ponadto umożliwia czasem nawet
identyfikację konkretnych genomów u mieszańców (KIM i in. 2002). Jej wadą jest duża
zmienność mikrosatelitów powodująca, że nawet różne odmiany danego gatunku wykazują
różną ich dystrybucję w chromosomach (CUADRADO & JOUVE 2002). Z tego powodu bardziej ogólna charakterystyka kariotypu danego gatunku z użyciem wspomnianej metody
może być trudna. W analizie kariotypu przydatne być mogą także sondy wykrywające inne
wysoko powtarzalne sekwencje, np. sekwencje satelitarne występujące w heterochromatynie. Mogą one być np. pomocne w identyfikacji chromosomów jednego z rodziców u mieszańców (BRASILEIRO-VIDAL i in. 2005) lub B-chromosomów (HOUBEN i in. 1996).
Inna niestandardowa metoda FISH polega na hybrydyzacji z sondami otrzymanymi
z bibliotek genomowych danego gatunku (HASTEROK i in. 2006). Jest to metoda precyzyjna, umożliwiająca fizyczne mapowanie sekwencji na chromosomach, umożliwiająca ich
identyfikację w kariotypie, poza tym przydatna w badaniach porównawczych, ponieważ
sekwencje wyizolowane z jednego gatunku mogą znakować chromosomy innego gatunku.
W miarę wzrostu liczby zaawansowanych badań molekularnych u różnych traw, liczne
sekwencje DNA tych roślin staną się łatwiej dostępne, co umożliwi upowszechnienie tego
typu analiz.
Specjalną odmianą FISH jest metoda umożliwiająca znakowanie (malowanie) konkretnego chromosomu lub jego części. Przeprowadza się ją z wykorzystaniem DNA wyizolowanego i zamplifikowanego (najczęściej metodą PCR) z danego chromosomu lub jego
części. Izolacja chromosomów lub ich fragmentów przeprowadzana jest na drodze cytometrycznego sortowania lub laserowej mikromanipulacji. W ten sposób na przykład sporządzano sondy malujące dłuższe ramię chromosomu 5B u pszenicy (VEGA i in. 1994).
122
Księga Polskich Traw
GISH stanowi niewątpliwie najbardziej użyteczną w analizie cytogenetycznej traw
modyfikację fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Pierwotnym przeznaczeniem tej metody
było barwienie genomów rodzicielskich w kariotypie naturalnie powstałych allopoliploidów i sztucznie otrzymanych mieszańców, zarówno diploidalnych, jak i poliploidalnych.
Z powodzeniem zastosowano ją m.in. w analizie pochodzenia poliploidów Festuca, Avena,
Aegilops, Triticum i Zea (RAINA & RANI 2001).
Szczególnie wiele interesujących obserwacji z użyciem GISH przeprowadzono nad
sztucznie otrzymanymi mieszańcami zarówno zbóż, jak i traw użytkowych. Badania tego
typu mają duże znaczenie praktyczne, ponieważ umożliwiają nie tylko potwierdzenie mieszańcowego charakteru otrzymanych przez hodowców roślin, ale i monitorowanie zachowania się genomów rodzicielskich w kolejnych pokoleniach mieszańców (ZWIERZYKOWSKI
i in. 2006). Jednym z najbardziej interesujących wyników tych badań jest odkrycie, iż
rodzicielskie genomy występujące u allopoliploidów rekombinują ze sobą, oraz że częstość
i zakres rekombinacji są zaskakująco duże. Zmiany rekombinacyjne zachodzą już na wczesnym etapie formowania allopoliploidów i doprowadzają do powstania zrekombinowanych
chromosomów, zawierających fragmenty pochodzące z różnych genomów. Szczególnie
frapujące wydaje się to, że rekombinacja ta najwyraźniej nie zależy od stopnia pokrewieństwa genomów (co wydawałoby się w jakiś sposób zrozumiałe), występuje bowiem także
u mieszańców międzyrodzajowych (KOSINA & HESLOP-HARRISON 1996; ZWIERZYKOWSKI
i in. 1998, 2003, 2006). Ślady zachodzenia rekombinacji pomiędzy genomami odnaleziono
także u naturalnie powstałych poliploidów z rodzaju Avena i Triticum (RAINA & RANI
2001).
Wszystkie te odkrycia burzą zarysowany przez klasyków biosystematyki roślin (Stebbinsa, Stace’a) i ich licznych następców, statyczny obraz kariotypu alopoliploidów, w którym współistnieją genomy zasadniczo identyczne z tymi, które występowały u rodziców,
a ewentualne zmiany w ich budowie są powolne i stanowią efekt gromadzenia się drobnych
mutacji i działania doboru naturalnego.
Za pomocą GISH można analizować nie tylko skład genomowy mieszańców, ale naturalnych i sztucznie otrzymanych polihaploidów (JAUHAR 2006), a także chromosomy,
grupy chromosomów lub fragmenty chromosomów jednego gatunku obecne w kariotypie
innego gatunku (np. wprowadzone na sztucznej drodze) (LE i in. 1989; MUKAI & GILL 1991;
ARMSTEAD i in. 2001; BRASILEIRO-VIDAL i in. 2005; PRIETO i in. 2006). Badania tego typu
mają przede wszystkim praktyczne znaczenie, dlatego też prowadzone są głównie na liniach
sztucznych mieszańców introgresywnych zbóż i traw użytkowych, używanych w pracach
hodowlanych.
LITERATURA
ARMSTEAD I. P., BOLLARD A., MORGAN W. G., HARPER J. A., KING I. P., JONES R. N., FORSTER J. W.,
HAYWARD M. D. & THOMAS H. M. 2001. Genetic and physical analysis of a single Festuca pratensis
chromosome segment substitution in Lolium perenne. – Chromosoma 110: 52–57.
AVDULOV N. P. 1931. Karyosystematische Untersuchungen der Familie Gramineen. – Bull. Appl. Bot. Gen.
and Plant Breed. Suppl. 44: 1–428.
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
123
BENNETZEN J. L. 2000a. Transposable element contribution to plant gene and genome evolution. – Pl. Mol.
Biol. 42: 251–269.
BENNETZEN J. L. 2000b. Mechanism and rates of genome expansion and contraction in flowering plants.
– Genetica 115: 29–36.
BENNETZEN J. L. & FREELING M. 1993. Grasses as a single genetic system: Genome composition, colinearity and compatibility. – Trends Genet. 9: 259–261.
BENNETZEN J. L. & KELLOGG E. 1997. Do plants have a one-way ticket to genomic obesity? – Plant Cell
9: 1509–1514.
BOLKHOVSKIKH Z., GRIF V., MATVEJEVA T. & ZAKHARYEVA O. 1969. Chromosome numbers of flowering
plants. s. 926. Nauka, Leningrad.
BRASILIERO-VIDAL A. C., CUADRADO A., BRAMMER S. P., BENKO-ISEPPON A. M. & GUERRA M. 2005.
Molecular cytogenetic characterization of parental genomes in the partial amphidiploid Triticum aestivum × Thinopyrum ponticum. – Gen. Mol. Biol. 28: 308–313.
BREMER K. 2002. Gondwanian evolution of the grass alliance of families (Poales). – Evolution 56:
1374–1387.
COMAI L., MADLUNG A., JOSEFSSON C. & TYAGI A. 2003. Do the different parental ‘heteromes’ cause
genomic shock in newly formed allopolyploids? – Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 358: 1149–1155.
CUADRADO A. & JOUVE N. 2002. Evolutionary trends of different repetitive DNA sequences during speciation in the genus Secale. – J. Hered. 93: 339–345.
DEVOS K. M. & GALE M. D. 2000. Genome relationships: the grass model in current research. – Plant
Cell 12: 637–646.
DEWET J. M. J. 1986. Hybridization and polyploidy in the Poaceae. – W: T. SODERSTROM, K. W. HILU,
C. S. CAMPBELL & M. E. BARKWORTH (red.), Grass systematics and evolution, s. 188–194. Smithsonian
Institution Press, Washington DC.
DOU Q. W., TANAKA H., NAKATA N. & TSUJIMOTO H. 2006. Molecular cytogenetic analyses of hexaploid
lines spontaneously appearing in octoploid triticale. – Theor. Appl. Genet., w druku.
DRAPER J., MUR L. A. J., JENKINS G., GHOSH-BISWAS G. C., BABLAK P., HASTEROK R. & ROUTLEDGE
P. M. 2001. Brachypodium distachyon. A new model system for functional genomics in grasses. – Plant
Physiol. 127: 1539–1555.
FELDMAN M., LUPTON F. G. H. & MILLER T. E. 1995. Wheats. – W: J. SMARTT & N. W. SIMMONDS (red.),
Evolution of crop plants, s. 184–192. Longman Group, London.
FELDMAN M., LIU B., SEGAL G., ABBO S., LEVY A. A. & VEGA J. M. 1997. Rapid elimination of low-copy
DNA sequences in polyploid wheat: a possible mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes. – Genetics 147: 1381–1387.
FREY L. 2000. Trawy niezwyciężone (wybrane zagadnienia z historii, taksonomii i biologii Poaceae).
– Łąkarstwo w Polsce 3: 9–20.
GALE M. D., DEVOS K. M. & MOORE G. 1996. Rice as the pivotal genome in the new era of grass comparative genetics. International Rice Research Institute. 1996. Rice genetics III. Proceedings of the Third
International Rice gentics Symposium, 16–20 Oct. 1995. Manila (Philippines): IRRI. s. 77–84.
GAUT B. S. 2002. Evolutionary dynamics of grass genomes. – New Phytol. 154: 15–28.
GILL B. S. 1981. Evolutionary relationships based on heterochromatin bands in six species of the Triticinae.
– J. Hered. 72: 391–394.
HASTEROK R., DRAPER J. & JENKINS G. 2004. Laying the cytotaxonomic foundations of a new model grass,
Brachypodium distachyon (L.) Beauv. – Chromosome Res. 12: 397–403.
124
Księga Polskich Traw
HASTEROK R., MARASEK A., DONNISON I. S., ARMSTEAD I., THOMAS A., KING I. P., WOLNY E., IDZIAK D.,
DRAPER J. & JENKINS G. 2006. Alignment of the genomes of Brachypodium distachyon and temperate
cereals and grasses using bacterial artificial chromosome landing with fluorescence in situ hybridisation. – Genetics 173: 349–362.
HOUBEN A., KYNAST R. G., HEIM U., HERMAN H., JONES R. N. & FORSTER J. W. 1996. Molecular cytogenetic characterization of the terminal heterochromatic segment of the B-chromosome of rye (Secale
cereale). – Chromosoma 105: 97–103.
HUANG S., SIRIKHACHORNKIT A., SU X., FARIS J., GILL B., HASELKORN R. & GORNICKI P. 2002. Genes
encoding plastid acetyl-CoA carboxylase and 3-phosphoglycerate kinase of the Triticum/Aegilops
complex and the evolutionary history of polyploidy wheat. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:
8133–8138.
JAUHAR P. P. 2006. Spontaneous haploids in durum wheat: their cytogenetic characterization. – Euphytica
148: 341–344.
JELLEN E. N., PHILLIPS R. L., RINES H. W. 1993. C-banded karyotypes and polymorphisms in hexaploid
oat accessions (Avena spp.) using Wright’s stain. – Genome 36: 1129–1137.
JENKINS G., HASTEROK R. & DRAPER J. 2003. Building the molecular cytogenetic infrastructure of a new
model grass. – W: Z. ZWIERZYKOWSKI, M. SURMA & P. KACHLICKI (red.), Application of novel cytogenetic and molecular techniques in genetics and breeding of the grasses, s. 77–84. Institute of Plant
Genetics PAS, Poznań, Poland.
JOACHIMIAK A. 1983a. Metody różnicowego barwienia chromosomów. – Wiad. Bot. 27: 11–30.
JOACHIMIAK A. 1983b. Heterochromatyna. Budowa i funkcje w obrębie genomu. – Post. Biol. Kom. 10:
317–337.
JOACHIMIAK A. 2005. Heterochromatin and microevolution in Phleum. – W: A. K SHARMA & A. SHARMA
(red.), Plant genome. Biodiversity and Evolution. 2B: Phanerogams, s. 89–117. Science Publishers Inc.,
Enfield (NH), USA, Plymouth, UK.
JOACHIMIAK A. & KULA A. 1993. Cyto-taxonomy and karyotype evolution in Phleum sect. Phleum
(Poaceae) in Poland. – Plant Syst. Evol. 188: 17–30.
JOACHIMIAK A. & KULA A. 1996. Karyosystematics of the Phleum alpinum polyploid complex (Poaceae).
– Plant Syst. Evol. 203: 11–25.
JOACHIMIAK A., KULA A. & GRABOWSKA-JOACHIMIAK A. 1997. On heterochromatin in karyosystematic
studies. – Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 39: 69–77.
KELLOGG E. A. 1998. Relationships of cereal crops and other grasses. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
2005–2010.
KELLOGG E. A. 2000. The grasses: A case study in macroevolution. – Annu. Rev. Ecol. Syst., 31:
117–238.
KELLOGG E. A. & BENNETZEN J. L. 2004. The evolution of nuclear genome structure in seed plants. – Am.
J. Bot. 91: 1709–1725.
KIM N.-S. ARMSTRONG K. C., FEDAK G., HO K., & PARK N.-I. 2002. A microsatellite sequence from the
rice blast fungus (Magnaporthe grisea) distinguishes between the centromeres of Hordeum vulgare and
H. bulbosum in hybrid plants. – Genome 45: 165–174.
KOSINA R. & HESLOP-HARRISON J. S. 1996. Molecular cytogenetics of an amphidiploid trigeneric hybrid between Triticum durum, Thinophyrum distichum and Lophopyrum elongatum. – Ann. Bot. 78:
583–589.
KOTSERUBA V., GERNAND D., MEISTER A. & HOUBEN A. 2003. Uniparental loss of ribosomal DNA in the
allotetraploid grass Zingeria trichopoda (2n = 8). – Genome 46: 156–163.
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
125
KUBALAKOVA M., VALARIK M., BARTOS J., VRANA J., CIHALIKOVA J., MOLNAR-LANG M. & DOLEZEL
J. 2003. Analysis and sorting of rye (Secale cereale L.) chromosomes using flow cytometry. – Genome 46: 893–905.
KULA A. 2005. Kariologia i morfologia gatunków z rodzaju Phleum. – Zesz. Nauk. Akademii Rolniczej
w Krakowie 418 Rozprawy 304: 1–171.
KULA A., STEWART A., ŚLIWIŃSKA E., PALECZNY A. & GALANT B. 2007. Analiza cytogenetyczna obustronnych mieszańców pomiędzy Phleum commutatum [4x] i Phleum pratense [4x]. – Acta Agr. Silv. Ser.
Agr., w druku.
LE H. T., ARMSTRONG K. C. & MIKI B. 1989. Detection of rye DNA in wheat-rye hybrids and wheat translocation stocks using total genomic DNA probe. – Plant Mol. Biol. Rep. 7: 150–158.
LEITCH I. & BENNETT M. D. 2004. Genome downsizing in polyploid plants. – Biol. J. Linn. Soc. 82:
651–663.
LI D. & ZHANG X. 2002. Physical localization of the 18S-5.8S-26S rDNA and sequence analysis of ITS
regions in Thinopyrum ponticum (Poaceae: Triticeae): Implications for concerted evolution. – Ann.
Bot. 90: 445–452.
LINDE-LAURSEN I., VON BOTHMER R. & JACOBSEN N. 1990. Giemsa C-banded karyotypes of diploid and
tetraploid Hordeum bulbosum (Poaceae). – Plant Syst. Evol. 172: 141–150.
LYSAK M. A., CIHALIKOVA J., KUBALAKOVA M. SIMKOVA H., KUNZEL G. & DOLEZEL J. 1999. Flow karyotyping and sorting of mitotic chromosomes of barley (Hordeum vulgare L.). – Chromosome Res. 7:
431–444.
MAŁUSZYŃSKA J. 1999. Porównawcze badania organizacji genomu roślinnego. – Post. Biol. Kom. 26:
507–522.
MCCLINTOCK B. 1933. The association of non-homologous parts of chromosomes in the midprophase of
meiosis in Zea mays. – Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 19: 191–237.
MCCLINTOCK B. 1984. The significance of responses of the genome to challenge. – Science 226:
792–801.
MEYERS L. A. & LEVIN D. A. 2006. On the abundance of polyploids in flowering plants. – Evolution 60:
1198–1206.
MILLER J. T., DONG F., JACKSON S. A., SONG J. & JIANG J. 1998. Retrotransposon-related DNA sequences
in the centromeres of grass chromosomes. – Genetics 150: 1615–1623.
MIZIANTY M. 1995. Trawy – grupa roślin, która odniosła ewolucyjny sukces. – Wiadomości botaniczne
39(1–2): 59–70.
MIZIANTY M. 2007. Kariologia traw. – W: L. FREY (red.), Księga polskich traw, s. 77–107. Instytut Botaniki im. W. Szafera Polska Akademia Nauk, Kraków.
MOLINA M. DEL C. & NARANJO C. A. 1987. Cytogenetic studies in the genus Zea. 1. Evidence for five as
the basic chromosome number. – Theor. Appl. Genet. 73: 542–550.
MOORE G. 1995. Cereal genome evolution: pastoral pursuits with ‘lego’ genomes. – Curr. Op. Gen. Dev.
5: 717–724.
MOORE G. 2000. Cereal chromosome structure, evolution, and pairing. – Ann. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 51: 195–222.
MOORE G., DEVOS K. M., WANG Z. & GALE M. D. 1995. Grasses, line up and form a circle. – Curr. Biol.
5: 737–739.
MUKAI Y. & GILL B. S. 1991. Detection of barley chromatin added to wheat by genomic in situ hybridization. – Genome 34: 448–452.
126
Księga Polskich Traw
MÜNTZING A. 1935. Cyto-genetic studies on hybrids between two Phleum species. – Hereditas 20:
103–136.
NORDENSKIÖLD H. 1941. Cytological studies in triploid Phleum. – Bot. Not. 1941: 12–32.
NORDENSKIÖLD H. 1945. Cyto-genetic studies in the genus Phleum. – Acta Agric. Suecana 1: 1–138.
OHRI D. 1998. Genome size variation and plant systematics. – Ann. Bot. 82 (Suppl. A): 75–83.
OKAMOTO M. 1957. A synaptic effect on chromosome V. Wheat – Inf. Serv. 5: 6–7.
OZKAN H., LEVY A. A. & FELDMAN M. 2001. Allopolyploidy-induced rapid genome evolution in the wheat
(Aegilops-Triticum) group. – Plant Cell 13: 1735–1747.
OZKAN H., TUNA M. & ARUMUGANATHAN K. 2003. Nonadditive changes in genome size during allopolyploidization in the wheat (Aegilops-Triticum) group. – J. Hered. 94: 260–264.
PASZKO B. 2006. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. – Plant Syst. Evol.
258: 39–48.
PILCH J. 1981. Analysis of the rye chromosome constitution and the amount of telomeric heterochromatin
in the widely and narrowly adopted hexaploid triticales. – Theor. Appl. Gen. 60: 145–149.
PRIETO P., RAMIREZ C., CABRERA A., BALLESTEROS J. & MARTIN A. 2006. Development and cytogenetic
characterization of a double goat grass-barley chromosome substitution in tritordeum. – Euphytica
147: 337–342.
RAINA S. N. & RANI V. 2001. GISH technology in plant research. – Meth. Cell Sci. 23: 83–104.
RAJHATHY T. & THOMAS H. 1972. Genetic control of chromosome pairing in hexaploid oats. – Nature New
Biol. 239: 217–219.
RAMSEY J. & SCHEMSKE D. W. 2002. Neopolyploidy in flowering plants. – Ann. Rev. Ecol. Syst. 33:
589–639.
RILEY R. & CHAPMAN V. 1958. Genetic control of the cytological diploid behaviour of hexaploid wheat.
– Nature 182: 712–715.
ROGALSKA S. M. 1977. Identification of rye chromosomes in lines of hexaploid Triticale. – Genet. Pol.
18: 123–128.
ROGALSKA S. M. 2005. Genome diversity of triticale (× Triticosecale Witt.) using the chromosome heterochromatin marker. – W: A. K. SHARMA & A. SHARMA (red.), Plant genome. Biodiversity and Evolution.
2B: Phanerogams, s. 179–194. Science Publishers Inc., Enfield (NH), USA, Plymouth, UK.
ROGALSKA S., MAŁUSZYŃSKA J. & OLSZEWSKA M. J. 1999. Podstawy cytogenetyki roślin. s. 266. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
ROGALSKA S. M., ACHREM M., SŁOMIŃSKA-WALKOWIAK R., FILIP E., SKUZA L., PAWŁOWSKA J. & APOLINARSKA B. 2002. Polymorphism of heterochromatin bands on chromosomes of rye Secale vavilovii
Grossh. lines. – Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 44: 111–117.
SALINA E. A., NUMEROVA O. M., OZKAN H. & FELDMAN M. 2004. Alterations in subtelomeric tandem
repeats during early stages of allopolyploidy in wheat. – Genome 47: 860–867.
SANDHU D. & GILL K. S. 2002. Gene-containing regions of wheat and the other grass genomes. – Plant
Physiol. 128: 803–811.
SCHWARZACHER T. 2003. Meiosis, recombination and chromosomes: a review of gene isolation and fluorescent in situ hybridisation data in plants. – J. Exp. Bot. 54: 11–23.
SEARS E. R. 1954. The aneuploids of common wheat. – Missouri Agric. Exp. Stn. Res. Bull. 572: 1–58.
SHANTZ H. L. 1954. The place of grasslands in the earth’s cover of vegetation. – Ecology 35: 143–145.
SOBIESZCZAŃSKA A. 2000. Analysis of somatic chromosome numbers in doubled haploid lines of hexaploid
triticale (× Triticosecale Witt.). – Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 42(1): 109–114.
A. Joachimiak & A. Kula: Cytogenetyka traw
127
STACE C. A. 1993. Taksonomia roślin i biosystematyka. s. 340. Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa.
STEBBINS G. L. 1947. The origin of the complex of Bromus carinatus and its phylogeographic implications.
– Contr. Gray Herb. 165: 42–55.
STEBBINS G. L. 1950. Variation and evolution in plants. Columbia University Press, New York.
STEBBINS G. L., TOBGY H. A. & HARLAN J. R. 1944. The cytogenetics of hybrids in Bromus II. Bromus
carinatus and Bromus arizonicus. – Proc. Calif. Acad. Sci. 25: 307–322.
SUCHANKOVA P., KUBALAKOVA M., KOVAROVA P., BARTOS J., CIHALIKOVA J., MOLNAR-LANG M., ENDO
T. R. & DOLEZEL J. 2006. Dissection of the nuclear genome of barley by chromosome flow sorting.
– Theor. Appl. Genet. 113: 651–659.
TUNA M., GILL K. S. & VOGEL K. P. 2001. Karyotype and C-banding pattern of mitotic chromosomes in
diploid bromegrass (B. riparius Rehm.). – Crop Sci. 41: 831–834.
TUNA M., VOGEL K. P. & ARUMUGANATHAN K. 2005. Genome size and Giemsa C-banded karyotype of
tetraploid Bromus ciliatus L. – Euphytica 146: 177–182.
TUNA M., VOGEL K. P. & ARUMUGANATHAN K. 2006. Cytogenetic and nuclear DNA content characterization of diploid Bromus erectus and Bromus variegatus. – Crop Sci. 46: 637–641.
VEGA J. M., ABBO S., FELDMAN M. & LEVY A. A. 1994. Chromosome painting in plants: in situ hybridization with a DNA probe from a specific microdissected chromosome arm of common wheat. – Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 12041–12045.
VICIENT C. M., JAASKELAINEN M. J., KALENDAR R. & SCHULMAN A. H. 2001. Active retrotransposons are
a common feature of grass genomes. – Plant Physiol. 125: 1283–1292.
YANG Y. F., FURUTA Y., NAGATA S. & WATANABE N. 1999. Tetra Chinese Spring with AABB genomes
extracted from the hexaploid common wheat, Chinese Spring. – Genes Genet. Syst. 74: 67–70.
ZWIERZYKOWSKI Z., TAYYAR R., BRUNELL M. & ŁUKASZEWSKI A. J. 1998. Gene recombination in intergeneric hybrids between tetraploid Festuca pratensis and Lolium multiflorum. – J. Hered. 89: 324–328.
ZWIERZYKOWSKI Z., ZWIERZYKOWSKA E., KOSMALA A., ŁUCZAK M. & JOKŚ W. 2003. Genome recombination in early generations of Festuca pratensis × Lolium perenne hybrids. – W: Z. ZWIERZYKOWSKI,
M. SURMA & P. KACHLICKI (red.), Application of novel cytogenetic and molecular techniques in genetics and breeding of the grasses, s. 63–69. Institute of Plant Genetics PAS, Poznań, Poland.
ZWIERZYKOWSKI Z., KOSMALA A., ZWIERZYKOWSKA E., JONES N., JOKŚ W. & BOCIANOWSKI J. 2006.
Genome balance in six successive generations of the allotetraploid Festuca pratensis × Lolium perenne.
– Theor. Appl. Genet. 113: 539–547.
Cytogenetics in grasses
SUMMARY
The paper was an attempt to present the key problems and a review of basic research methods used in
grass cytogenetics. Particular attention was paid to still existing limitations in this field and ways of overcoming them.
From the 1930s to about the late1960s the major role in cytogenetic studies on grasses was played by
the classical analysis of the karyotype and analysis of meiosis. The problems which appeared then, such as
weak morphological differentiation of chromosomes and high percentage of allopolyploids possessing of
only slightly differentiated genomes, did not prevent grasses from becoming one of the cytologically best
examined plant families at that time. The dynamic progress of research was mainly stimulated by practical
needs but it was also connected with fast developing biosystematic studies.
128
Księga Polskich Traw
The 1970s brought the development of chromosome banding methods which provided a better insight
into chromosome and karyotype structures of many grasses. The widest application in karyotype analysis
of these plants has the C-banding method, which enables staining of heterochromatin. The 1990s marked
the beginning of the development of new directions, mainly based on nucleic acid hybridization in situ
(FISH, GISH) and studies on the amount of nuclear DNA carried out using flow cytometry. Wider and
wider application of these methods in cytogenetics of grasses suggests fast progress which will probably
provide a much better insight into the structure of the grass genome and explanation of the origin of numerous polyploid species. Moreover, the results of such studies will definitely deepen our knowledge of
phylogenetic relationships within the grass family and will shed new light on mechanisms of karyotype
evolution within this group.