Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

Nr kat. EM03, EM04
Wersja zestawu: 1.2014
Zestaw do izolacji DNA z tkanek
zwierzęcych oraz linii komórkowych
EXTRACTME® jest zastrzeżonym
znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM03, EM04
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME DNA TISSUE przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji
DNA o wysokiej czystości z tkanek stałych (świeżych, mrożonych, utrwalonych
w formalinie lub zatopionych w parafinie), płynów fizjologicznych, włosów,
ogonów gryzoni, owadów oraz linii komórkowych. Protokół izolacji i składy
buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiej
wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie
do zastosowań badawczo–rozwojowych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
LICZBA IZOLACJI
50
IZOLACJI
150
IZOLACJI
250
IZOLACJI
3 IZOLACJE
(DEMO)
Nr katalogowy
EM03–050
EM03–150
EM03–250
EM03–D
TL Buffer
20 ml
60 ml
100 ml
1,2 ml
1 szt.
3 szt.
5 szt.
1 szt.
200 µl
600 µl
1 ml
100 µl
1 szt.
3 szt.
5 szt.
1 szt.
Proteinase Buffer
1,3 ml
3,9 ml
6,5 ml
200 µl
TB Buffer (conc.)
8,8 ml
26,4 ml
44 ml
1,2 ml**
TW1 Buffer (conc.)*
20 ml
60 ml
100 ml
2,1 ml**
TW2 Buffer (conc.)*
8,2 ml
24,6 ml
41 ml
1,5 ml**
Elution Buffer
12 ml
3 x 12 ml
5 x 12 ml
0,8 ml
DNA Purification Columns
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Bead-Beating Tubes*
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
(Tissue Lysis Buffer)
RNase A (lyophilized)
RNase Buffer
Proteinase K (lyophilized)
*
(Binding Buffer)
(Wash Buffer 1)
(Wash Buffer 2)
do zestawu EXTRACTME
Enzymy RNaza A oraz proteinaza K dostarczane są w postaci liofilizowanej.
Każda probówka zawiera odpowiednią ilość enzymu do przeprowadzenia 50
izolacji DNA. Liofilizaty RNazy A i proteinazy K należy przechowywać w temp.
+4°C. Przed pierwszym użyciem liofilizat RNazy A należy rozpuścić w 200 µl
RNase Buffer (w zestawie DEMO w 100 µl buforu). Roztwór RNazy A należy
przechowywać w temp. –20°C!
3
* Odnosi sie wyłącznie
DNA TISSUE PLUS.
Probówki z kulkami
do homogenizacji
(Bead-Beating Tubes)
posiadają wypełnienie cyramiczne.
Liofilizat proteinazy K należy rozpuścić w 1,3 ml Proteinase Buffer (w zestawie DEMO
w 200 µl buforu). Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. –20°C!
Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15–25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany
zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy.
Przed pierwszym użyciem do buforów TB, TW1 i TW2 należy dodać odpowiednią
ilość 96–100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli).
Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki.
**
Uwaga: w zestawie DEMO (EM03–D) bufory TB, TW1 i TW2 zawierają już etanol.
*
LICZBA IZOLACJI
50 IZOLACJI
150 IZOLACJI
250 IZOLACJI
Nr katalogowy
EM03–050
EM03–150
EM03–250
TB Buffer
8,8 ml
26,4 ml
44 ml
Etanol 96–100%
13,2 ml
39,6 ml
66 ml
Całkowita objętość
22 ml
66 ml
110 ml
TW1 Buffer
20 ml
60 ml
100 ml
Etanol 96–100%
20 ml
60 ml
100 ml
Całkowita objętość
40 ml
120 ml
200 ml
TW2 Buffer
8,2 ml
24,6 ml
41 ml
Etanol 96–100%
19,2 ml
57,6 ml
96 ml
Całkowita objętość
27,4 ml
82,2 ml
137 ml
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
www.dnagdansk.com
pp
pp
96–100% etanol cz.d.a.
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml)
pp
pp
pp
pp
pp
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na 1,5–2 ml probówki (>10 tys. rpm)
termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C)
worteks
4
Nr kat. EM03, EM04
Opcjonalnie
pp ksylen – bloczki parafinowe
pp bufor PBS – linie komórkowe, tkanki w formalinie, płyny fizjologiczne
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
przygotowanie: rozpuścić 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO 4 oraz
0,24 g KH2PO4 w 800 ml H2O. Dodać HCl do pH 7,4. Dopełnić do 1000 ml
i autoklawować. Przechowywać w temp. +4°C.
1 M DTT – włosy
przygotowanie: 1,54 g DTT rozpuścić w 10 ml H2O. Rozporcjować
i przechowywać w temp. -20°C.
nożyczki, skalpel
probówki z kulkami ceramicznym
homogenizator tkankowy na probówki 2 ml
homogenizator nożowy
termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm
moździerz z gładkim wylewem (50–75 ml) z dopasowanym pistonem
ciekły azot lub suchy lód
worteks z przystawką na probówki 2 ml
wirówka z rotorem na probówki 10 –15 ml (płyny fizjologiczne,
linie komórkowe).
IV. ZASADA IZOLACJI
Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i jest przeprowadzana
z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże
wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Pierwszym etapem jest
homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację połączeń międzykomórkowych
(tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację wysokocząsteczkowych białek (tkanka
mięśniowa, łączna). Następnie homogenat poddawany jest lizie enzymatycznej
z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu TL oraz silnej proteazy
(proteinazy K). Na tym etapie degradacji ulegają błony oraz wszystkie białka
komórkowe. W przypadku tkanki aktywnej metabolicznie, RNA jest usuwane przy
zastosowaniu RNazy A. Po zwirowaniu celem eliminacji niestrawionych resztek
tkanki, supernatant zmieszany z solami chaotropowymi nanoszony jest na złoże
minikolumny. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu
usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych.
Oczyszczone DNA eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej
(Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0) i jest gotowe do bezpośredniego
wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, QPCR,
Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi,
ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia.
5
V.
SPECYFIKACJA PRODUKTU
MATERIAŁ WYJŚCIOWY
pp
tkanka stała świeża lub mrożona: 1–30 mg
pp
tkanka utrwalona w formalinie: 1–30 mg
pp
tkanka w bloczku parafinowym: 1–30 mg
pp
linie komórkowe: 103 –107 komórek
pp
płyny fizjologiczne (mocz, PMR, płyn otrzewnowy): 1–5 ml
pp
włosy: 1–30 mg
pp
ogony gryzoni: 1–30 mg
pp
owady: 1–30 mg
WYDAJNOŚĆ IZOLACJI
Przykładowe wydajności izolacji DNA ze świeżego materiału biologicznego podane
są w sekcji XIV.
POJEMNOŚĆ ZŁOŻA
ok. 30 µg DNA
CZAS IZOLACJI
pp
ok. 12 minut (po etapie lizy)
pp
30–40 minut w przypadku homogenizacji mechanicznej
pp
1–16 h w przypadku zastosowania okresowego worteksowania
CZYSTOŚĆ DNA
A 260/A 280 = 1,6–1,9
VI. KONTOLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA TISSUE testowana
jest według wewnętrznych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność
wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi
oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego
DNA sprawdzana jest w reakcji PCR , QPCR oraz reakcji trawienia
enzymami restrykcyjnymi.
www.dnagdansk.com
6
Nr kat. EM03, EM04
VII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
TL, TB, TW1 BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H315, H318, H319, H411,
P273, P280, P305+P351+P338
PROTEINASE K
Niebezpieczeństwo
H315, H319, H334, H335,
P261, P305+P351+P338, P342+P311
TW2 BUFFER
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336,
P210, P261, P305+P351+P338
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H225
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315
Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa
drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności
w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie
dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy.
H411 Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. P210
Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących
powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/
mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280
Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy.
P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać
wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo
usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony
układu oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem.
7
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Elucja DNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności
od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia
DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 100–200 μl Elution Buffer przy izolacji
z 2–10 mg tkanki lub <104 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego
do 200 μl w przypadku izolacji z 10–30 mg tkanki lub 10 4 –107 komórek.
Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć do 50 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że
obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu
elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W przypadku małej ilości materiału wyjściowego lub materiału o niskiej zawartości
DNA zaleca się przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie
precypitacji DNA według standardowych procedur.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy
podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 5 minut.
Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można
przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć
pkt. 13–15 Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce
1,5 ml typu Eppendorf.
Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może może niekorzystnie
wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne.
Zanieczyszczenia RNA
Większość świeżych lub mrożonych tkanek zawiera więcej RNA niż DNA,
szczególnie tkanki aktywne metabolicznie, tj. gruczoły, tkanka nerwowa, nabłonki.
Obecność RNA może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych,
ale nie wpływa na inhibicję PCR. W celu otrzymania oczyszczonego preparatu
genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać 4 μl roztworu RNase A i
inkubować 5 min w temp. 37°C (pkt. 3 Protokołu izolacji).
Pienienie buforu TL
Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym, może
dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas
etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu
usunięcia piany probówkę należy wirować przez 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g).
www.dnagdansk.com
8
Nr kat. EM03, EM04
IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać.
2.
Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej
ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer).
W razie potrzeby przygotować roztwór RNase A poprzez rozpuszczenie
liofilizatu w odpowiedniej ilości buforu do RNazy (RNase Buffer).
Należy upewnić się czy do buforów TB, TW1 i TW2 został dodany etanol.
Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane
są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II).
W przypadku wytrącenia się osadu w buforach, butelkę z roztworem należy
ogrzać do temp. 50–60°C i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia się
osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
Nagrzać termoblok, termomikser lub łaźnię wodną do temp. 55°C.
Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C.
Należy pamiętać, żeby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp.
pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
X.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA
Ilość: 1–30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie.
Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji
Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze
fragmenty. Przejść do wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do pkt.
1 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Ciekły azot, suchy lód (LN2, CO2)
1. Zamrożoną w LN2 lub CO2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym
moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie
rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć.
2.
9
Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 375 μl
TL Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku,
zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 375 μl TL Buffer
i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki
(2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki.
Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego
1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl TL Buffer, homogenizować
ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora.
2.
3.
Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą 275 μl
TL Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (polecamy zestaw
EXTRACTME DNA TISSUE PLUS, w skład którego wchodzą dodatkowo probówki
z kulkami)
1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 150 μl TL Buffer i przenieść
pociętą tkankę. Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym
i rozdrabniać przez 30 s przy 5–6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie
konieczności.
W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki
spowodowanej pienieniem buforu probówkę zwirować przez 2 min przy
10 tys. rpm (11 tys. x g).
W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić
korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min
przy maksymalnych obrotach.
2. Dodać 225 μl TL Buffer, wymieszać przez pipetowanie.
3. Do probówki dodać 25 μl Proteinase K oraz 4 μl RNase A. Zworteksować
przez 20 s. Inkubować 5 min w temp. 37°C.
4. Przejść do pkt. 4 Protokołu izolacji (sekcja XI).
B. TKANKA UTRWALONA W FORMALINIE
Ilość: 1–30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce przechowywane w 4% formalinie
w warunkach chłodniczych przez minimum 1 h.
1.
2.
www.dnagdansk.com
Usunąć formalinę poprzez dwu– lub trzykrotne przepłukanie tkanki
roztworem PBS lub H2O.
Formalina jest drażniąca. Nie zaleca się sprawdzania prawidłowości
odpłukania formaliny przez wąchanie oparów z probówki.
Dalej postępować jak w przypadku tkanek świeżych (pkt. A).
10
Nr kat. EM03, EM04
C. TKANKA ZATOPIONA W PARAFINIE
Ilość: 1–30 mg; Materiał: tkanki zwierzęce zatopione w bloczkach parafinowych
przeprowadzonych przez standardową procedurę histologiczną.
1.
Z bloczka parafinowego wyciąć fragment o masie max 30 mg i umieścić
w probówce (2 ml).
2. Dodać 1 ml ksylenu. Worteksować przez 30 s.
Ksylen jest toksyczny, drażniący i bardzo palny. Pracować pod
włączonym wyciągiem.
3. Wirować 5 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). Usunąć supernatant
przez pipetowanie.
4. Powtórzyć etapy 2–3.
5. Dodać 1 ml 96–100% etanolu. Wymieszać przez pipetowanie lub
worteksowanie 15 s.
6. Wirować 2 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g). Usunąć supernatant
przez pipetowanie.
7. Powtórzyć etapy 5–6.
8. Suszyć osad w temp. 50°C w otwartej probówce przez 5–20 min celem
pozbycia się etanolu.
9. Dodać 375 μl TL Buffer, wymieszać przez worteksowanie przez 20 s.
10. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
D. LINIE KOMÓRKOWE
Ilość: 103 –107 komórek; Materiał: świeże lub mrożone (-80°C lub -196°C) linie
komórek adherentnych lub zawiesinowych.
1.
2.
3.
4.
11
Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37°C. Komórki w pożywce lub PBS
zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys.
rpm (ok. 3 tys. x g). W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy
należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS.
Dodać 375 μl buforu TL. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s, a następnie pipetowanie.
Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty)
i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~107)
mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w TL Buffer. Należy wtedy
rozpipetować ostrożnie z wykorzystaniem pipety z końcówką >1000 ml lub
jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem.
Całość przenieść do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
E. PŁYNY FIZJOLOGICZNE
Ilość: do 5 ml płynu; Materiał: mocz, płyn mózgowo–rdzeniowy, płyn z jamy
otrzewnej, opłucnej, plwocina.
Do izolacji DNA z krwi polecamy dedykowany zestaw EXTRACTME DNA BLOOD,
a do izolacji z wymazów lub nasienia zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN.
Płyny fizjologiczne są materiałem cennym diagnostycznie, a jednocześnie
stanowią duże zagrożenie ze względu na potencjalną zawartość patogenów
i/lub komórek nowotworowych. Należy zachować szczególną ostrożność podczas
pracy z tym materiałem.
1.
2.
3.
4.
Mocz oraz inne płyny: w zależności od objętości, zwirować w odpowiedniej
probówce/falkonie przez 5 min przy 2 tys. rpm (ok. 500 x g). Supernatant odrzucić.
Plwocina: przed wirowaniem należy dodać odpowiednią ilość środka
mukolitycznego (bromheksyna, acetylocysteina). Wirować 5 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g). Supernatant odrzucić.
Osad komórkowy przepłukać za pomocą 1 ml PBS lub soli fizjologicznej,
wirować 1 min przy 5 tys. rpm (ok. 3 tys. x g).
Dodać 375 μl TL Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s.
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
F. WŁOSY
Ilość: 10–30 mg włosów (ok. 100–120 sztuk), do 30 mg cebulek włosa.
Materiał: włosy, najlepiej z cebulkami lub same cebulki. Tylko cebulki zawierają
żywe komórki, natomiast w pozostałej części włosa znajdują się resztki komórek
ze zdegradowanym gDNA oraz mtDNA. Stąd też aplikacje, takie jak PCR lub QPCR,
powinny uwzględniać produkty o wielkościach ≤ 200 pz.
1.
2.
3.
4.
www.dnagdansk.com
Cebulki odciąć od włosów i umieścić w probówce (2 ml). Jeśli włosy
pozbawione są cebulek, pociąć je na fragmenty o długości maksymalnie 3 mm.
Dodać 375 μl TL Buffer. Dodać 40 μl 1M DTT oraz 25 μl Proteinase K.
Wymieszać przez worteksowanie 30 s.
Dodatek DTT jest opcjonalny. Większość rodzajów włosów powinna
ulec strawieniu bez dodatku tego odczynnika, jednakże niektóre rodzaje
włosów (np. kręcone) zawierają zbyt dużą ilość mostków dwusiarczkowych,
uniemożliwiających całkowite strawienie samą proteinazą K.
Inkubować minimum 6 h (lub przez noc) w temp. 55°C. Należy okresowo
worteksować przez 1–2 min. Bardzo przydatny jest termomikser.
Po całkowitym strawieniu przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI).
12
Nr kat. EM03, EM04
W przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się
przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji
DNA według standardowych procedur.
G. OGONY GRYZONI
Ilość: do 30 mg; Materiał: ogon szczura lub myszy.
1.
2.
3.
4.
Ogon pociąć nożyczkami/skalpelem na jak najmniejsze fragmenty i umieścić
w probówce (2 ml).
W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące
homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej.
Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować przez 20 s.
Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37°C przez
5 min, następnie w temp. 55°C w zależności od stopnia rozdrobnienia
tkanki: 2–3 h przy dobrej homogenizacji lub 5–16 h przy pracy na pociętych
fragmentach. Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1–2 h. Polecany
jest termomikser.
Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI).
H. OWADY
Ilość: 1–30 mg; Materiał: owady w różnych stadiach rozwoju; świeże, mrożone,
utrwalone w formalinie lub etanolu.
1.
2.
3.
4.
5.
13
Owady utrwalone w formalinie lub etanolu przemyć dwukrotnie za pomocą
1 ml PBS lub wody destylowanej, wirować 1 min przy 2 tys. rpm (ok. 500 x
g) i przejść do pkt. 3. Owady świeże lub mrożone – homogenizować (pkt. 2).
Homogenizacja – pociąć owady na jak najmniejsze fragmenty. Ucierać
w moździerzu w ciekłym azocie na proszek, następnie przenieść do probówki
(2 ml). Można także zastosować kulki ceramiczne (według procedury opisanej
w pkt. A).
W celu szybkiego rozdrabniania przydatne są wskazówki dotyczące
homogenizacji tkanki świeżej lub mrożonej.
Dodać 375 μl TL Buffer, intensywnie worteksować przez 60 s.
Dodać 4 μl RNase A oraz 25 μl Proteinase K. Inkubować w temp. 37°C przez
5 min, następnie w temp. 55°C w zależności od stopnia rozdrobnienia tkanki: 2–3
h przy dobrej homogenizacji lub 5–16 h przy pracy na pociętych fragmentach.
Worteksować przez 20 s przynajmniej co 1–2 h. Polecany jest termomikser.
Przejść do pkt. 5 Protokołu izolacji (sekcja XI).
W przypadku małej ilości materiału wyjściowego zaleca się
przeprowadzenie elucji w 200 µl Elution Buffer, a następnie precypitacji
DNA według standardowych procedur.
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce
(2 ml). Dodać 375 μl TL Buffer. Worteksować przez 20 s.
W przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez 1–2 min
przy 10 tys. rpm (11 tys. x g). Patrz pkt. IX. Szczególne zalecenia i uwagi.
2. Dodać 25 μl Proteinase K i wymieszać przez odwracanie probówki.
3. Umieścić probówkę w termobloku, termomikserze lub łaźni
wodnej w temp. 55°C, aż do czasu całkowitego strawienia
materiału biologicznego. W miarę możliwości, co 30–60 min
probówkę intensywnie worteksować przez 20 s.
4. Opcjonalnie dodać 4 μl roztworu RNase A. Inkubować 5 min
w temp. 37°C.
Usuwanie RNA zalecane jest szczególnie w przypadku tkanek aktywnych
metabolicznie oraz gdy niezbędne jest wyizolowanie DNA całkowicie
wolnego od RNA.
5. Dodać 400 μl TB Buffer i wymieszać przez worteksowanie 10 s.
6. Wirować 2 min przy 10–14 tys. rpm (11–21 tys. x g).
7.
Supernatant przenieść do minikolumny ze złożem, umieszczonej
w probówce odbierającej, uważając, żeby nie zaciągnąć resztek
niestrawionej tkanki.
W przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych
należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając
końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą
ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć supernatant. Resztki tkanki
powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki.
www.dnagdansk.com
14
Nr kat. EM03, EM04
8. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
Po wirowaniu w minikolumnie nie powinno być płynu. W przypadku
pozostania niezwirowanego płynu w górnej części minikolumny należy
powtórzyć wirowanie przez 2 min przy maksymalnej prędkości.
9. Do minikolumny dodać 600 μl buforu płuczącego TW1
Buffer i wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
10. Do minikolumny dodać 500 μl buforu płuczącego TW2 Buffer
i wirować 2 min przy 10–14 tys. rpm (11–21 tys. x g).
Bufory płuczące zawierają etanol, który może powodować inhibicję
niektórych reakcji enzymatycznych, dlatego istotne jest jego całkowite
usunięcie przed etapem elucji. W tym celu po drugim etapie płukania można
dodać etap „wirowania na sucho”. Po opróżnieniu probówki odbierającej, należy
wirować suchą minikolumnę przez 2 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
11. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
12. Nanieść na środek złoża 100–200 μl Elution Buffer uprzednio
podgrzanego do 70°C. Inkubować przez 3 min.
13. Wirować 2 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
14. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać
w +4°C lub –20°C do czasu dalszych analiz.
15
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji DNA.
Tkanka
nieprawidłowo rozdrobniona.
Upewnić się, że tkanka została odpowiednio
zhomogenizowana w buforze TL. Tkankę należy uprzednio
pokroić na jak najmniejsze fragmenty a następnie dobrać
odpowiednią metodę homogenizacji.
Tkanka źle przechowywana
i/lub utrwalona –
degradacja DNA.
Przechowywać tkankę w temp. -80°C. Unikać
częstego rozmrażania i zamrażania. W przypadku
utrwalania upewnić się co do jakości utrwalacza oraz
warunków przechowywania.
Brak dostatecznej lizy tkanki.
Proteinaza K musi mieć odpowiednie warunki do reakcji
enzymatycznej – upewnić się czy tkanka jest dostatecznie
rozdrobniona, wydłużyć okres worteksowania, inkubować
tkankę w buforze TL + proteinaza K przez 16 h.
Zmniejszona aktywność
proteinazy K.
Złe warunki przechowywania proteinazy K.
W przypadku pracy z materiałem z pkt. X.B,C,E,H należy
starannie przemyć osad komórkowy roztworem PBS.
Niecałkowita elucja DNA.
Podgrzać Elution Buffer do temp. 80°C. Nanieść centralnie
na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji do 5 min.
Przeprowadzić powtórną elucję.
Niewłaściwe pH buforu
elucyjnego lub wody
(pH <7,0).
Do elucji użyć Elution Buffer.
Zatkana minikolumna.
Patrz problem z zatkaną minikolumną.
Niekompletna
degradacja białek.
Użyć świeżej proteinazy K. Wydłużyć okres worteksowania,
inkubować tkankę w buforze TL + proteinaza K przez 16 h,
do czasu aż roztwór będzie klarowny.
Zmniejszona aktywność
proteinazy K.
Złe warunki przechowywania proteinazy K.
W przypadku pracy z materiałem z pkt. X.B,C,E,H należy
starannie przemyć osad komórkowy roztworem PBS.
Przeładowanie minikolumny.
Nie przekraczać zalecanej ilości tkanki lub komórek.
Wadliwa
homogenizacja tkanki.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji (pkt. X.A).
Niekompletna
degradacja białek.
Użyć świeżej proteinazy K. Wydłużyć okres worteksowania,
inkubować tkankę w buforze TL + proteinaza K przez 16 h,
do czasu aż roztwór będzie klarowny.
Przeniesienie osadu
komórkowego na
złoże minikolumny.
Ostrożnie przenieść supernatant bez naruszania
resztek komórek.
Niska wartość
A260/A280
Zatkana
minikolumna.
www.dnagdansk.com
16
Nr kat. EM03, EM04
Zdegradowane
DNA
Tkanka zbyt stara.
Używać tkanek świeżych lub odpowiednio utrwalonych.
Niewłaściwe przechowywanie
i/lub utrwalanie tkanki
Przechowywać tkankę w temp. -80°C. Unikać
częstego rozmrażania i zamrażania. W przypadku
utrwalania upewnić się co do jakości utrwalacza
oraz warunków przechowywania.
DNA fizycznie zdegradowane
przez zbyt gwałtowną
homogenizację
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji (pkt. X.A).
Inhibicja
enzymatycznej
obróbki
wyizolowanego
DNA
Resztki buforu płuczącego
TW2 Buffer w eluacie
Po drugim etapie płukania dodać etap
„wirowania na sucho”.
Kontaminacja RNA
Tkanka o wysokiej zawartości
RNA
Przeprowadzić trawienie RNase A (pkt. 3 Protokołu izolacji).
XIII. ŚREDNI CZAS OBRÓBKI ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
MATERIAŁ
Masa/ilość
Objętość elucji Stężenie DNA
A 260/A 280
Ilość DNA
Wątroba szczura
30 mg
200 µl
235,2 ng/µl
1,86
47,0 µg
Mięsień szkieletowy szczura
20 mg
200 µl
50,5 ng/µl
1,80
10,1 µg
Serce szczura
20 mg
200 µl
123,5 ng/µl
1,84
24,7 µg
Tkanka tłuszczowa żółta
30 mg
200 µl
49,0 ng/µl
1,80
9,8 µg
Tkanka tłuszczowa brunatna
30 mg
200 µl
116,7 ng/µl
1,88
23,3 µg
Nerka szczura
20 mg
200 µl
183,4 ng/µl
1,79
36,7 µg
Linie komórkowe HT29
1 x 10
5
200 µl
51,5 ng/µl
1,81
10,3 µg
Linie komórkowe HCT116
3 x 10
6
200 µl
60,0 ng/µl
1,61
12,0 µg
Mózg szczura
20 mg
200 µl
9,4 ng/µl
1,69
1,88 µg
Owady
2,7 mg
30 µl
12,9 ng/µl
1,65
0,39 µg
17
XIV. WYDAJNOŚCI IZOLACJI DNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
MATERIAŁ
Trawienie w
termobloku, bez
homogenizacji,
worteksowanie
okresowe
Trawienie w
termomikserze
Homogenizacja w
ciekłym azocie
Homogenizacja
z kulkami
ceramicznymi
Orientacyjny
całkowity czas
lizy
Wątroba szczura
3–6 h
2–4 h
1–2 h
≤1h
Min. 1 h
Max 6 h
Mięsień
szkieletowy
szczura
2–3 h
2h
≤1h
0,5–1 h
Min. 0,5 h
Max 3 h
Serce szczura
2–3 h
1–1,5 h
≤1h
0,5–1 h
Min. 0,5 h
Max 3 h
Tkanka tłuszczowa
żółta
1–1,5 h
1h
0,5 h
0,5 h
Min. 0,5 h
Max 1,5 h
Tkanka tłuszczowa
brunatna
1–1,5 h
1h
0,5 h
0,5 h
Min. 0,5
Max 1,5 h
Nerka szczura
1,5–3 h
0,5–2 h
0,5–1,5 h
0,5–1,5 h
Min. 0,5 h
Max 3 h
Linie komórkowe
HT29
0,5–1 h
5–30 min
Brak danych
ok. 5 min
Min. 5 min
Max 1 h
Linie komórkowe
HCT116
0,5–1 h
5–30 min
Brak danych
ok. 5 min
Min. 5 min
Max 1 h
Mózg szczura
0,5–1 h
0,5–1 h
Brak danych
Brak danych
Min. 0,5 h
Max 1 h
Owady
Brak danych
1–2 h
0,5–2 h
0,5–2 h
Min. 0,5 h
Max 2 h
XV. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
pp
pp
pp
pp
pp
Tkanka jest materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość mikroorganizmów
patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Należy stosować się do
wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II bezpieczeństwa biologicznego,
używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów DNA pomiędzy
kolejnymi minikolumnami.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu
z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw
wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu.
www.dnagdansk.com
18
Nr kat. EM03, EM04
www.dnagdansk.com
BLIRT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80–172 Gdańsk, www.dnagdansk.com
T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: [email protected]