pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 411–423
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
ANNA MILCZAREK, BARBARA CEBULA, TADEUSZ ROBAK,
PIOTR SMOLEWSKI
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy białkowej Akt na
komórki ostrej białaczki szpikowej
Cytotoxic effect of Akt kinase inhibitor on acute myeloid leukemia
cells
Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak
STRESZCZENIE
Przedmiotem przeprowadzonych badań była analiza aktywności przeciwnowotworowej nowego
inhibitora Akt (Akt-I, 1L-6-Hydroxymethyl-chiro-inositol2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate), w odniesieniu do komórek ostrej białaczki szpikowej (OBS) i komórek linii HL-60,
oraz ocena efektywności skojarzenia Akt-I z cytostatykami rutynowo stosowanymi w leczeniu
indukującym OBS, doksorubicyną (DOX) oraz cytarabiną (CYT). Oceniano działanie cytostatyczne stosowanych leków, posługując się testami z jodkiem propydyny (JP) oraz MTT. Analizowano takŜe efekt proapoptotyczny leków oraz ich wpływ na cykl komórkowy. Badano ekspresję kinazy Akt, cyklin A, D1, D2, D3 i E, a takŜe wybranych białek regulujących apoptozę (Bak,
Bax, Bcl-2, p53, p73).
Stwierdzono, Ŝe Akt-I powodował istotne zahamowanie proliferacji w porównaniu z równoległymi próbkami kontrolnymi (w stosunku do kontroli – p=0.025) w teście MTT. Jednocześnie,
inkubacja z Akt-I nie indukowała znaczącego odsetka apoptotycznych komórek HL-60. Ponadto,
Akt-I wykazywał hamujący wpływ na cykl komórkowy, blokując komórki HL-60 w fazie G1 cyklu oraz indukując znamienny spadek ekspresji cyklin D1 i D3 (Akt-I vs. kontrola – odpowiednio p=0,032 i p=0.015). Odnośnie kombinacji Akt-I oraz CYT i/lub DOX, najkorzystniejszy
efekt obserwowano dla Akt-I w skojarzeniu z DOX (p=0.003). Łączne stosowanie wszystkich
badanych leków powodowało zwiekszenie działania proapoptotycznego w stosunku do efektu
poszczególnych leków (p<0.05). Skojarzenie Akt-I, DOX i CYT indukowało statystycznie znamienne zmiany w ekspresji białek Bak oraz Bcl-2. Po 24 godz. hodowli ekspresja proapototycznego Bak w próbkach z Akt-I+DOX+CYT była istotnie wyŜsza, a ekspresja antypototycznego
białka Bcl-2 istotnie niŜsza niŜ w równoległych próbkach kontrolnych niŜ równoległych próbkach kontrolnych (odpowiednio: p =0.007 i 0.019).
Podsumowując, komórki białaczkowe w warunkach in vitro wykazują wraŜliwość na działanie
Akt-I. Akt-I zastosowany pojedynczo hamuje proliferację komórek HL-60, blokując cykl komórkowy w fazie G1, nie indukując apoptozy tych komórek. Dodanie inhibitora kinazy Akt do
cytostatyków rutynowo stosowanych w OBS, DOX i CYT, powoduje wzrost ich efektu proapoptotycznego. Przedstawione wyniki dostarczają teoretycznych podstaw do kontynuowania badań
nad skutecznością skojarzonego działania inhibitorów kinazy Akt i konwencjonalnych cytostatyków w OBS.
412 A. MILCZAREK i wsp.
SŁOWA KLUCZOWE: Ostra białaczka szpikowa – Inhibitory kinazy Akt – Doksorubicyna – Cytarabina – Apoptoza – Cykl komórkowy
SUMMARY
In this study we analyzed the anti-tumor effect of a new Akt kinase inhibitor (Akt-I), 1L-6Hydroxymethyl-chiro-inositol2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate, used alone and in routine cytostatics (doksorubicine, DOX and cytarabine, CYT) on acute myeloid leukemia (AML)derived cell line, HL-60. Cytotoxicity of these drugs was evaluated using both propydium iodide
(PJ) and MTT assay. Their influence on apoptosis and the cell cycle, as well as on expression of
Akt kinase, cyclines (A, D1, D2, D3, E), and several apoptosis-regulating proteins (Bak, Bax,
Bcl-2, p53, p73) was also assessed.
Incubation with Akt-I induced significant inhibition of HL-60 cell proliferation (vs. control p=0.025), without distinct proapototic effect. Moreover, Akt-I blocked cell cycle of leukemic
cells in their G1 phase due to significant reduction of cyclines D1 and D3 expression (Akt-I vs.
control –p=0,032 and p=0.015, respectively). With regard to combination of Akt-I with CYT
and/or DOX, the strongest anti-tumor effect was observed for Akt-I+DOX (p=0.003). Simultaneous incubation with all examined drugs triggered proapoptotic effect higher than particular
drugs used alone (p<0.05). Combination of Akt-I, DOX and CYT induced significant changes in
expression of Bak and Bcl-2 proteins after 24h of incubation, increasing Bak and decreasing Bcl2 compared to control, p=0.007 and 0.019, respectively).
In conclusion, leukemic HL-60 cells are sensitive to Akt-I treatment in vitro. Akt-I alone inhibits
their proliferation, arresting cells in G1 phase. Addition of Akt-I to drugs routinely used in AML
results in further increase in their proapototic effect. These data provide a rationale for further
studies on combination of treatment with inhibitors of Akt kinase and conventional chemotherapy in this disease.
KEY WORDS: Acute myeloid leukemia – Akt kinase inhibitor – Doxorubicine – Cytarabine – apoptosis – Cell cycle
WSTĘP
Pomimo niewątpliwych postępów w leczeniu ostrej białaczki szpikowej (OBS),
wyleczenie większości chorych wciąŜ nie jest moŜliwe. Dlatego trwają bardzo intensywne badania nad szeregiem nowych leków i strategii terapeutycznych (1). Jednym
z najbardziej obiecujących kierunków jest tak zwane leczenie biologiczne, celowane na
mechanizmy, których zaburzenia są istotą rozwoju i przetrwania klonu nowotworowego (1).
Jedną z atrakcyjnych strategii leczenia przeciwnowotworowego jest hamowanie
szlaków prowadzących do proliferacji komórki. Jego załoŜeniem jest próba blokowania mechanizmów, które leŜą u podłoŜa rozwoju nowotworu, na przykład dróg wewnątrzkomórkowej sygnalizacji odpowiedzialnej za przeŜycie komórki i jej proliferację (2, 3). Do najwaŜniejszych naleŜy szlak sygnalizacyjny PI3K/Akt/mTOR (PI3K
(phosphatidylinositol-3 kinase) / Akt (protein kinase B) / mTOR (mammalian target of
rapamycin)). Inhibitory działające na róŜnych poziomach tego szlaku są w ostatnich
latach przedmiotem intensywnych badań przedklinicznych i klinicznych (4, 5, 6).
Ostatnio, bardzo wiele badań dotyczy zastosowania inhibitorów kinazy mTOR w onkologii, w tym w leczeniu chorób nowotworowych krwi (6). Udowodniono równieŜ, Ŝe
hamowanie kinazy PI3K wywołuje silny efekt przeciwnowotworowy (5).
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
413
W wielu komórkach nowotworowych, w tym w komórkach białaczkowych w
OBS, dochodzi do stałej nadekspresji kinazy Akt (8, 9). JednakŜe skuteczność hamowania tego punktu szlaku PI3K/Akt/mTOR jest jednak wciąŜ przedmiotem wstępnych
badań przedklinicznych (9–14).
Jeden z ostatnio zsyntetyzowanych inhibitorów Akt, 1L-6-Hydroxymethyl-chiroinositol2-((R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate) (15), określany dalej skrótem AktI, nie był dotychczas badany w kontekście efektu przeciwnowotworowego. W związku
z powyŜszym podjęto próbę takich badań w modelu in vitro, na komórkach wywodzących się z OBS. W ramach przeprowadzonych badań analizowano aktywność przeciwnowotworową Akt-I w oparciu o badanie jego wpływu cytotoksycznego oraz wpływu
na cykl komórkowy. Ponadto, poddano ocenie efektywność skojarzenia Akt-I z cytostatykami rutynowo stosowanymi w leczeniu indukującym OBS – doksorubicyną
(DOX) oraz cytarabiną (CYT).
MATERIAŁ I METODY
Hodowle komórkowe
Badania in vitro prowadzono na komórkach linii ostrej białaczki szpikowej, HL-60
(American Type Culture Collection, ATCC, USA). Hodowle komórkowe prowadzono
w 48-studzienkowych płytkach lub w 25ml i 75ml naczyniach hodowlanych (Nunc,
Dania). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w próbkach zawierających komórki
HL-60 w wyjściowym stęŜeniu 0,5×106/ml. śywotność komórek uŜywanych do doświadczeń była większa niŜ 90%.
Hodowle utrzymywano przez 24 godz. w medium RPMI 1640 (Cambrex Bio
Science, Verviers, Belgia) z dodatkiem 10% cielęcej surowicy płodowej, 100j/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy (wszystkie odczynniki
z Gibco, Life Technologies, Scotland). Hodowle prowadzono w inkubatorze, w temperaturze 37.5o C, w atmosferze wzbogaconej o 5% CO2. Badania przyŜyciowe (test cytotoksyczności) wykonywano bezpośrednio po zakończeniu hodowli. Komórki przeznaczone do innych badań (apoptoza, cykl komórkowy, badania ekspresji białek)
utrwalano. W tym celu, do komórek zawieszonych w buforze PBS (Phosphate Buffered Saline, Sigma Aldrich, Niemcy) dodawano zimnego, 85% etanolu w stosunku 1:9
na 30 minut w temperaturze 0oC. Tak przygotowaną zawiesinę przechowywano w temperaturze –20oC.
Schemat stosowania leków
Komórki HL-60 inkubowano z inhibitorem Akt (Akt-I; MBL, Woburn, MA, USA,
Nr kat. JM-1701-1), a takŜe z DOX oraz CYT, pojedynczo oraz w skojarzeniach. We
wstępnych doświadczeniach Akt-I uŜywano w zakresie stęŜeń od 1µ do 10µM. Do
dalszego etapu badań wybrano stęŜenie 10µM, jako dawkę powodującą znamienne
zahamowanie cyklu komórkowego linii komórek HL-60 w fazie G1 – po 24 godz. ho-
414 A. MILCZAREK i wsp.
dowli (p<0.001 w stosunku do kontroli). DOX oraz CYT stosowano w dawkach ustalonych na podstawie wcześniej prowadzonych eksperymentów. Mianowicie, DOX
stosowano w dawce 365nM, a CYT w dawce 50nM.
Ocena cytotoksyczności leków
Test z jodkiem propydyny. Oceny cytotoksyczności dokonywano w oparciu o pomiar Ŝywotności komórek linii HL-60 przed załoŜeniem hodowli oraz po inkubacji
z lekami, przy uŜyciu jodku propydyny (JP). JP jest kationowym związkiem wykazującym autofluorescencję, który jest aktywnie eliminowany przez komórki zdrowe, z zachowaną integralnością błony komórkowej (komórki JP-ujemne, JP-). Natomiast komórki umierające w mechanizmie apoptozy bądź martwicy nie są w stanie uwolnić JP
do środowiska zewnętrznego (komórki JP-dodatnie, JP+). Badane próbki płukano
dwukrotnie, zawieszając je w 5ml PBS (Sigma Aldrich, Niemcy), odwirowując przez
5 minut przy 1100 obrotów/minutę. Następnie komórki zawieszano w mieszaninie
50µl PBS i 10µl JP (Sigma -Aldrich, Niemcy). Po 10 minutowej inkubacji, prowadzonej w ciemności, w temperaturze pokojowej, oceniano Ŝywotność komórek przy uŜyciu
cytometru przepływowego. śywotność była oceniana w odniesieniu do odpowiednich
kontroli (równoległych hodowli komórek bez dodatku leku).
Test MTT. Cytotoksyczność badanych leków badano równieŜ testem MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma Aldrich,
Niemcy). W tym celu stęŜony roztwór barwnika (5 mg/ml) rozcieńczano do uzyskania
stęŜenia 0.1 mg/ml. Następnie dodawano 1/10 objętości roztworu do kaŜdej hodowli
i inkubowano przez 4 godziny. W czasie inkubacji Ŝółty barwnik MTT wskutek aktywności oksydoredukcyjnej mitochondriów (pod wpływem dehydrogenaz) ulegał
redukcji do purpurowych kryształów formazanu. Pod koniec inkubacji usuwano medium, a do kryształów formazanu dodawano 0.5 M roztwór HCl. Absorpcję roztworu
oznaczano spektrofotometrycznie przy uŜyciu czytnika płytek, Microplate Reader Model 550 (BioRad, USA), przy długości fali 570 nm.
Badanie efektu proapototycznego: ocena frakcji subG1. Głównym miernikiem
efektu przeciwnowotworowego badanych leków było ich działanie proapototyczne.
Spośród markerów nieodwracalnej fazy apoptozy, jaką jest fragmentacja DNA, wybrano ocenę frakcji hypoploidalną subG1 na histogramie DNA. Zasada tego testu oparta
jest na zjawisku, Ŝe permabilizacja i utrwalenie komórek nie zapobiega ekstrakcji drobnych fragmentów zdegradowanego DNA w trakcie ich kilkukrotnego płukania i barwienia. Dlatego teŜ komórki apoptotyczne, posiadające mniejszą ilość DNA, moŜna
zidentyfikować w histogramie jako frakcję subG1. Oceny frakcji subG1 dokonywano
jednocześnie z oceną cyklu komórkowego, w komórkach barwionych mieszaniną
5 ng/ml JP oraz 100 ng/ml RNA-azy.
Badanie wpływu leków na cykl komórkowy
Analiza cyklu komórkowego. Cykl komórkowy badano w oparciu o analizę rozkładu DNA w komórce i ekspresję cyklin charakterystycznych dla określonych faz cyklu
komórkowego. Indeks apoptotyczny (IA) określano na podstawie odsetka komórek
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
415
o zmniejszonej zawartości DNA (frakcja hypoploidalna, tzw. subG1). W trakcie tej
samej analizy określano odsetek komórek w fazie G1, S oraz G2M cyklu komórkowego. W tym celu uŜywano komórek, które po inkubacji z lekami zostały utrwalone
w 85% alkoholu etylowym (przez 30 minut w temperaturze 00C), a następnie przechowywano w temperaturze –200C. Przed barwieniem komórki płukano dwukrotnie w
5 ml PBS i wirowano w opisanych wyŜej warunkach. Po odwirowaniu kaŜdej z próbek
dodawano po 1ml mieszaniny 5 ng/ml JP oraz 100 ng/ml RNA-azy w PBS (Sigma
Aldrich, Niemcy) inkubując je następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemności. Bezpośrednio po inkubacji dokonywano pomiarów fluorescencji komórek w cytometrze przepływowym.
Badanie ekspresji białek regulujących apoptozę
Oceniano ekspresję wybranych białek regulujących apoptozę z rodzin Bcl-2 (Bcl-2,
Bax, Bak) oraz p53 (p53 i p73). W tym celu uŜywano następujące rozcieńczenia odpowiednich przeciwciał I-rzędowych: mysie anty-Bcl-2 (Sigma Aldrich, Niemcy) –
1:15, królicze anty-Bax (Dako, Dania) – 1:400 oraz mysie anty-p53 (Sigma Aldrich,
Niemcy) i anty-p73 (Dako, Dania) – 1:30. Próbki inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Rozcieńczenia wszystkich przeciwciał przygotowywano w PBS z dodatkiem 1% surowicy bydlęcej (BSA).
Następnie, po odpłukaniu w PBS/BSA, w zaleŜności od typu uŜytego przeciwciała
I-rzędowego dodawano przeciwciało II-rzędowe: anty-królicze lub anty-mysie
(wszystkie z Dako, Dania) w rozcieńczeniach 1:20 (30 minut, w temperaturze pokojowej, w ciemności). Po ponownym płukaniu komórek w PBS/BSA mierzono ekspresję
białek przy uŜyciu cytometru przepływowego.
Badanie ekspresji cyklin
Utrwalone wcześniej komórki przemywano dwukrotnie roztworem PBS. Osad rozprowadzano w 0,25% Triton-X-100 w PBS (Sigma-Aldrich, Niemcy) i inkubowano
1 minutę w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu do osadu dodawano 20 µl przeciwciał skierowanych przeciwko cyklinom: D1, D3, A (BD Pharmingen, USA), pozostawiając na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po upływie czasu inkubacji komórki odpłukiwano dwukrotnie, zawieszając następnie osad w 500 µl roztworu JP/RNAza. Po upływie 30 minutowej inkubacji, bez dostępu światła, w temperaturze pokojowej, w cytometrze przepływowym mierzono fluorescencję FL1- dla fluorescencji cyklin oraz FL3- dla czerwonej fluorescencji JP.
Mysie monoklonalne przeciwciała anty-cyclin D2 i anty-cyclin E uŜywane były
w rozcieńczeniach 1:20, komórki inkubowano przez 2 godziny, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Przeciwciało drugorzędowe anty-mysie stosowano w rozcieńczeniach 1:20, komórki inkubowano 30 minut, w temperaturze pokojowej, w ciemności.
Rozcieńczenia wszystkich przeciwciał przygotowywano w 1% PBS-BSA.
416 A. MILCZAREK i wsp.
Po upływie czasu inkubacji komórki odpłukiwano dwukrotnie, zawieszając następnie osad w 500 µl roztworu JP/RNA-za. Po upływie 30 minutowej inkubacji, bez dostępu światła, w temperaturze pokojowej, w cytometrze przepływowym mierzono fluorescencję FL1- dla fluorescencji cyklin, oraz FL3- dla czerwonej fluorescencji JP.
Badanie ekspresji kinazy Akt
Ekspresję białek szlaku Akt badano w komórkach, które po hodowli z lekami
utrwalono w 1% formaldehydzie oraz w 85% alkoholu, a następnie przechowywano
w temperaturze –200C. W celu dodatkowej permabilizacji, po dwukrotnym przepłukaniu w PBS i odwirowaniu (5 minut przy 1100 obrotów./min) komórki inkubowano
dodatkowo z 0,25%. Triton-100 (Sigma Aldrich, Niemcy) (5 minut w temperaturze
40C). Po ponownym odpłukaniu w PBS, komórki inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami. Oceniano ekspresję następujących białek: Akt, fosforylowanego Akt (AktP), za pomocą odpowiednich przeciwciał I-rzędowych (przeciwciała królicze; wszystkie białka z Cell Signaling, USA). Przeciwciała anty- Akt-P, dodawano w rozcieńczeniu 1:25. We wszystkich przypadkach inkubację prowadzono przez 30 minut, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym przepłukaniu w PBS i odwirowaniu
do próbek (w podanych wyŜej warunkach) dodawano przeciwciało II-rzędowe (antykrólicze; Dako, Dania) w rozcieńczeniu 1:20, a następnie inkubowano przez 30 minut
w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po ponownym przepłukaniu komórek w PBS
dokonywano pomiarów fluorescencji przy uŜyciu cytometru przepływowego.
Cytometria przepływowa
Wszystkie pomiary fluorescencji wykonane były na cytometrze przepływowym
FACSCalibur (Becton Dickinson, USA), wyposaŜonego w laser argonowy 488 nm
oraz przy wykorzystaniu oprogramowania komputerowego CellQuestPro (Becton Dickinson, USA). KaŜdorazowo oceniano 10 000 komórek. Fluorescencję komórek oceniano z uŜyciem standardowych filtrów zielonego – FL1 (długość fali: λ=530±20nm),
pomarańczowego – FL2 (λ=560–600nm) i czerwonego – FL3 (λ>600nm). W ocenie
ekspresji białek regulujących apoptozę analizowano średnie wartości fluorescencji
(mean fluorescence intensity, MFI).
Analiza statystyczna
W celu przeprowadzenia analizy wyliczano wartości średnie, mediany oraz odchylenia standardowe. Dla porównania wyników uzyskanych w próbkach kontrolnych
oraz poddanych działania leków zastosowano testy nieparametryczne: test Mann Whitney’a oraz test par Wilcoxon’a. Wartości p mniejsze niŜ 0,05 przyjmowano za istotne
statystycznie.
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
417
WYNIKI
Akt-I wywiera efekt cytotoksyczny na komórki OBS in vitro
Propoptotyczne działanie Akt-I badano w stęŜeniach leku 1-10µM, oceniając frakcję komórek hypoploidalnych („subG1)” w histogramie DNA. Wykazano, Ŝe w powyŜszych dawkach Akt-I nie indukuje znaczącego odsetka apoptotycznych komórek HL60 po 24-godzinnej inkubacji (Ryc. 1).
100
90
80
70
60
subG1
50
G1
40
S/G2M
30
20
10
0
Ctrl
1µM
5µM
10µM
Ryc. 1. Akt-I stosowano w stęŜeniach od 1 do 10 µM, w 24-godzinnych hodowlach in vitro. Określano
indeks apoptotyczny (IA), mierzony odsetkiem komórek frakcji subG1. Jednocześnie określano procent
komórek znajdujących się we frakcjach G1 oraz G2/M
Fig. 1. Akt-I was used in concentrations 1 do 10 µM in 24h cultures in vitro. Apoptotic index (AI) was
measured by the subG1 fraction. Simultaneously, a percentage of cells in G1 and G2/M fraction was determined
MTT (% Akt-I/Ctrl)
120
p=0.025
100
80
60
40
20
0
Ctrl
Akt-I
Ryc. 2. Cytotoksyczność Akt-I w dawce 10µM na komórki HL-60, po 24-godzinnej hodowli, w porównaniu z kontrolą (Ctrl). A – oceniana testem z JP, B – oceniana testem z MTT (podano wartości średnie ±
odchylenia standardowe)
Fig. 2. Cytotoxicity of 10µM Akt-I on HL-60 cells after 24h in comparison to control (Ctrl) in MTT assay
(means ± standard deviations are shown)
418 A. MILCZAREK i wsp.
W dawce 10µM, Akt-I nie indukował statystycznie znamiennego wzrostu cytotoksyczności mierzonej odsetkiem komórek JP+ (Ryc. 2 A i B). W teście MTT wykonywanym w analogicznych warunkach, Akt-I powodował średnio 73% zahamowanie
proliferacji w porównaniu z równoległymi próbkami kontrolnymi (w stosunku do kontroli – p=0.025).
Efekt Akt-I na cykl komórkowy komórek HL-60
Akt-I począwszy od stęŜenia 10 µM wykazywał hamujący wpływ na cykl komórkowy, która wywoływała wyraźny wzrost frakcji G1 w stosunku do kontroli bez leku
po 24 godzinach hodowli (Ryc. 1). Dlatego dalsze badania efektów hamowania kinazy
Akt przeprowadzono z uŜyciem 10µM Akt-I.
Swoistość działania Akt-I – wpływ na ekspresję Akt-P
W 24-godzinnych hodowlach komórek linii HL-60, Akt-I indukowała znaczący
spadek ekspresji białka Akt i jego postaci fosforylowanej, Akt-P, w stosunku do kontroli (średnie MFI 56.7±24 vs. 35.0±17.4 oraz 27.0±10.5 vs. 13.2±11.96; odpowiednio
p = 0.025 i 0.007).
Wpływ Akt-I na ekspresję cyklin
W komórkach HL-60 Akt-I w dawce 10 µM indukował spadek ekspresji cyklin D
i E, jednakŜe istotność statystyczną osiągnęły jedynie róŜnice w ekspresji cykliny D1
i D3 (Akt-I vs. kontrola – odpowiednio p=0.032 i p=0.015 (Ryc. 3).
Ryc. 3. Ekspresja cyklin A, D1, D2, D3 i E w komórkach HL-60 po 24-godzinnej inkubacji z Akt-I
Fig. 3. Expression of cyclin A, D1, D2, D3 and E in HL-60 cells after 24h incubation with Akt-I
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
419
Cytotoksyczność skojarzeń inhibitora Akt z innymi lekami
Badano wpływ skojarzonego działania Akt-I z CYT w stęŜeniu 50nM oraz DOX w
dawce 365nM (200ng/ml). Najkorzystniejszy efekt proapoptotyczny obserwowano dla
Akt-I w skojarzeniu z DOX (p=0.003). Stwierdzono takŜe, Ŝe łączne stosowanie
wszystkich badanych leków powoduje wzmocnienie działania proapoptotycznego w
stosunku do efektu poszczególnych leków (p<0.05) (Tabela 1).
Tabela 1. Efekt Akt-I, DOX i CYT, osobno i w połączeniach, na apoptozę (mierzoną odsetkiem frakcji
subG1) oraz cykl komórkowy komórek HL- 60 w 24-godzinnych hodowlach
Table 1. Effect of Akt-I, DOX i CYT, alone and in combinations, on apoptosis (as measured by the percent of subG1 fraction) and cell cycle of HL-60 cells in 24h cultures in vitro
CYT
Akt-I
+CYT
DOX
+CYT
Akt-I
+DOX
+CYT
% komórek
Apoptosis:
subG1
Ctrl
Akt-I
DOX
Akt-I
+DOX
1,0±0,7
2,0±0,7
13,8±5,2
24,4±2,2
4,2±1,6
3,1±0,4
23,2±8,0
32,8±0,8
G1
40,4±0,3
65,6±4,6
32,8±5,3
31,3±0,1
48,8±3,5
74,3±1,9
30,7±5,9
29,9±3,0
S/G2M
58,6±1,7
32,2±2,1
53,4±2,1
44,4±1,2
47,3±1,1
22,8±1,6
46,1±4,3
37,5±1,3
Wpływ leków na ekspresję białek regulujących apoptozę
Skojarzenie Akt-I, DOX i CYT indukowało statystycznie znamienne zmiany
w ekspresji białek Bak oraz Bcl-2. Po 24 godz. hodowli ekspresja proapototycznego
Ryc. 4. Działanie Akt-I, DOX i CYT osobno i w połączeniach, na komórki HL-60. Rycina przedstawia
róŜnice w ekspresji białek Bak, Bax, Bcl-2, p53 i p73 po 24 godz. hodowli (podano wartości średnie +/odchylenia standardowe).
Fig. 4. Activity of Akt-I, DOX i CYT, alone and in combinations, on HL-60 cells. The Figure shows
differences in expression of Bak, Bax, Bcl-2, p53 and p73 proteins after 24h of incubation (means +/standard deviations are shown)
420 A. MILCZAREK i wsp.
białka Bak w próbkach z Akt-I+DOX+CYT była istotnie wyŜsza niŜ w równoległych
próbkach kontrolnych (średnia MFI 67,0±36,1 vs. 139,8±12,5; p=0.007). Ekspresja
antyapototycznego białka Bcl-2 w próbkach z Akt-I+DOX+CYT była istotnie niŜsza
niŜ w równoległych próbkach kontrolnych (średnia MFI 137,2±58,4 vs. 96,4±8,3;
p=0.019) (Ryc. 4).
DYSKUSJA
Przeprowadzone badania są pierwszą analizą cytotoksyczności inhibitora kinazy
Akt – Akt-I, 1L-6-Hydroxymethyl-chiro-inositol2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate, w odniesieniu do komórek białaczkowych. Wykazały one wraŜliwość komórek
HL-60, wywodzących się z OBS, na działanie Akt-I. Efekt ten był szczególnie wyraźny w skojarzeniu z DOX i CYT, cytostatykami rutynowo stosowanymi w tej chorobie.
Aktywność przeciwnowotworową związków hamujących szlak PI3K/Akt/mTOR
potwierdzono w szeregu doniesień (16-19). Większość przeprowadzonych dotąd prób
klinicznych, dotyczy stosowania inhibitorów kinazy mTOR (20-22). Niewiele jest
doniesień na temat działania przeciwnowotworowego inhibitorów Akt. Uzasadnieniem
podjęcia badań na aktywnością inhibitora Akt w OBS była stwierdzona ekspresja Akt
na komórkach białaczkowych w tej chorobie (23, 24). Ponadto, jednym z waŜnych
elementów regulujących aktywność szlaku PI3K/Akt/mTOR jest białko supresorowe
PTEN. Utratę aktywności PTEN wykazano w zdecydowanej większości przypadków
OBS, co korelowało z fosforylacją Akt i wiązało się z krótszym czasem przeŜycia
u chorych z brakiem aktywności białka PTEN (26, 27).
Zastosowany w pracy Akt-I jest bardzo silnym inhibitorem kinazy Akt, co wykazano takŜe w badaniach własnych. Nie jest on jednak całkowicie wybiórczym inhibitorem Akt; wykazuje takŜe pewne działanie hamujące na kinazę PI3K (28). Uzyskane
wyniki wskazują, Ŝe Akt-I stosowany pojedynczo nie wywołuje apoptozy komórek
białaczkowych HL-60. Powoduje on natomiast zahamowanie proliferacji tych komórek, co potwierdzono testem MTT, przy braku istotnych róŜnic z kontrolą w teście
z JP. Głównym mechanizmem tego działania jest zahamowanie cyklu komórkowego
komórek HL-60 w fazie G1, co wiązało się ze znamiennym spadkiem ekspresji cyklin
D1 i D3.
Wcześniejsze badania efektu przeciwnowotworowego inhibitorów innych kluczowych kinaz szlaku PI3K/Akt/mTOR wykazały równieŜ ich dominujący efekt antyproliferacyjny w postaci zahamowania cyklu komórkowego komórek nowotworowego
w fazie G1 (29, 30). Ponadto, w przeciwieństwie do Akt-I, zarówno inhibitor kinazy
PI3K, LY294002, jak i inhibitor mTOR, rapamycyna, wykazywały zaleŜne od dawki
działanie proapototyczne (29, 30). Wyniki te mogą sugerować nieco mniejszy potencjał przeciwnowotworowy Akt-I, chociaŜ potwierdzenie tej tezy wymaga poszerzenia
badań na inne typy komórek nowotworowych, w tym na badania w modelu in vitro.
Od wielu lat w leczeniu indukującym OBS stosuje się połączenie antybiotyku antracyklinowego – DOX, oraz antymetabolitu pirymidyny – CYT. Dlatego w przeprowadzonych badaniach te właśnie leki zostały zastosowane w celu analizy potencjalne-
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
421
go wpływu Akt-I na zwiększenie efektu przeciwbiałaczkowego w modelu in vitro.
Dodanie Akt-I do hodowli komórek HL-60 powodowało bardzo silne wzmocnienie
efektu proapoptotycznego DOX. Ponadto, dalsze dołączenie CYT do tej kombinacji
skutkowało statystycznie znamiennym wzrostem indeksu apoptotycznego (IA) w porównaniu z efektem tych leków stosowanych pojedynczo. Uzyskane wyniki wskazują
więc na korzystne interakcje leku hamującego szlak kinazy Akt. Uzasadniają one potrzebę dalszych badań przedklinicznych w modelu ex vivo, a w przyszłości być moŜe
prób klinicznych. Wcześniejsze badania wskazujące na korzystny efekt skojarzenia
inhibitorów innych kinaz szlaku PI3K/Akt/mTOR z klasycznymi cytostatykami, potwierdzają takŜe zasadność prób dalszego rozwijania tej strategii w chorobach nowotworowych krwi (29–31).
Mechanizm przeciwnowotworowego działania klasycznych cytostatyków opiera
się na indukcji apoptozy komórek nowotworowych (32, 33). W tym kontekście szczególnie istotny wydaje się efekt połączenia Akt-I z cytostatykami stosowanymi w OBS,
którego działanie ograniczone jest, jak wspomniano, do hamowania cyklu komórkowego. UŜyty w tej samej dawce Akt-I wykazywał działanie „uczulające” na proapototyczny efekt DOX, a takŜe połączenie DOX i CYT. Mechanizm działania kombinacji
Akt-I+DOX+CYT opierał się na wzroście ekspresji proapoptotycznego białka Bak
oraz spadku ekspresji jednego z głównych inhibitorów apoptozy, białka Bcl-2. Dyskusja tej części wyników z innymi obserwacjami jest niemoŜliwa, poniewaŜ przeprowadzone badania są pierwszym doniesieniem dotyczącym łączenia leku hamującego szlaku kinazy Akt z efektem działania cytostatyków rutynowo stosowanych u chorych na
OBS.
Podsumowując, wyniki przeprowadzonych badań pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków:
1. Komórki linii OBS HL-60, w warunkach in vitro wykazują wraŜliwość na działanie Akt-I. Akt-I zastosowany pojedynczo hamuje proliferację komórek HL-60, blokując cykl komórkowy w fazie G1, nie indukując apoptozy tych komórek.
2. Dodanie inhibitora kinazy Akt do cytostatyków rutynowo stosowanych w OBS: DOX i CYT, powoduje dalszy wzrost ich efektu proapoptotycznego. Efektem tego
skojarzenia jest wzrost ekspresji proapoptotycznego białka Bak i spadek ekspresji białka Bcl-2, inhibitora apoptozy.
3. PowyŜsze wyniki dostarczają teoretycznych podstaw do kontynuowania badań
nad skutecznością skojarzonego działania inhibitorów kinazy Akt i konwencjonalnych
cytostatyków w OBS.
Praca finansowana z działalności statutowej Kliniki Hematologii nr 503-1093-1
422 A. MILCZAREK i wsp.
PIŚMIENNICTWO
1. Stone RM, O'Donnell MR, Sekeres MA. Acute myeloid leukemia. Hematology (Am Soc Hematol
Educ Program) 2004: 98-117.
2. Podar K, Raab MS, Chauhan D, Anderson KC. The therapeutic role of targeting protein kinase C in
solid and hematologic malignancies. Expert Opin Investig Drugs 2007; 16:1693-707.
3. Doepfner KT, Boller D, Arcaro A. Targeting receptor tyrosine kinase signaling in acute myeloid
leukemia. Crit Rev Oncol Hematol 2007; 63: 215-30.
4. Crowell JA, Steele VE, Fay JR. Targeting the AKT protein kinase for cancer chemoprevention.
Mol Cancer Ther 2007; 6: 2139-48.
5. Martelli AM, Tazzari PL, Evangelisti C, Chiarini F, Blalock WL, Billi AM, Manzoli L, McCubrey
JA, Cocco L. Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin module for
acute myelogenous leukemia therapy: from bench to bedside. Curr Med Chem 2007; 14: 2009-23.
6. Smolewski P. Investigating mTOR inhibitors for their anti-cancer properties. Exp Opin Invest
Drugs 2006; 17: 487-494.
7. Nicholson KM, Anderson NG. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy.
Cell Signal 2002; 14: 381-95
8. Min YH, Cheong JW, Kim JY i wsp. Cytoplasmic mislocalization of p27Kip1 protein is associated
with constitutive phosphorylation of Akt or protein kinase B and poor prognosis in acute myelogenous
leukemia. Cancer Res 2004; 64: 5225-31.
9. Crul M, Rosing H, de Klerk GJ i wsp. Phase I and pharmacological study of daily oral administration of perifosine (D-21266) in patients with advanced solid tumours. Eur J Cancer. 2002; 38: 1615-21.
10. Van Ummersen L, Binger K, Volkman J i wsp. A phase I trial of perifosine (NSC 639966) on a
loading dose/maintenance dose schedule in patients with advanced cancer. Clin Cancer Res 2004; 10:
7450-6.
11. Knowling M, Blackstein M, Tozer R i wsp. A phase II study of perifosine (D-21226) in patients
with previously untreated metastatic or locally advanced soft tissue sarcoma: A National Cancer Institute
of Canada Clinical Trials Group trial. Invest New Drugs 2006; 24: 435-9.
13. Ernst DS, Eisenhauer E, Wainman N i wsp. Phase II study of perifosine in previously untreated
patients with metastatic melanoma. Invest New Drugs. 2005; 23: 569-75.
13. Argiris A, Cohen E, Karrison T i wsp. A phase II trial of perifosine, an oral alkylphospholipid, in
recurrent or metastatic head and neck cancer. Cancer Biol Ther 2006; 5: 766-70.
14. Smorenburg CH, Seynaeve C, Bontenbal M i wsp. Phase II study of miltefosine 6% solution as
topical treatment of skin metastases in breast cancer patients. Anticancer Drugs 2000; 11: 825-8.
15. Hu Y, Qiao L, Wang S, Rong SB, Meuillet EJ, Berggren M, Gallegos A, Powis G, Kozikowski
AP. 3-(Hydroxymethyl)-bearing phosphatidylinositol ether lipid analogues and carbonate surrogates block
PI3-K, Akt, and cancer cell growth. J Med Chem 2000; 43: 3045-51.
16. Walker KS, Deak M, Paterson A i wsp. Actication of protein kinase B beta and gamma isoforms
by insulin in vivo and by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 in vitro: comparison with protein
kinase B alpha. Biochem J 1998; 331: 299-308.
17. Andjelkovic M, Alessi DR, Meier R. i wsp. Role of translocation in the activation and function of
protein kinase B. J Biol Chem 1997; 272: 31515-24.
18. Brazil DP, Park J, Hemmings BA. PKB binding proteins getting in on the Akt. Cell 2002; 111:
293-303.
19. Conus NM, Hannan KM, Cristiano BE i wsp. Direct identification of tyrosine 474 as a regulatory
phosphorylation site for the Akt protein kinase. J Biol Chem 2002; 277: 38021-8
20. Tee AR, Manning BD, Roux PP i wsp. Tuberous sclerosis complex gene products, Tuberin and
Hamartin, control mTOR signaling by acting as a GTPase-activating protein complex toward Rheb. Curr
Biol 2003; 13: 1259-68.
21. Harrington LS, Findlay GM, Gray A i wsp. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K
signaling via regulation of IRS proteins. J Cell Biol. 2004; 166: 213-23.
Cytotoksyczne działanie inhibitora kinazy Akt
423
22. Shah OJ, Wang Z, Hunter T. Inappropriate activation of the TSC/Rheb/mTOR/S6K cassette induces IRS1/2 depletion, insulin resistance, and cell survival deficiencies. Curr Biol. 2004; 14: 1650-6.
23. Wrzesień-Kuś A. Rola przeszczepiania hematopoetycznych komórek krwiotwórczych w ostrych
białaczkach u dorosłych. Nowa Klinika. 2000; 7: 615-618.
24. Pekarsky Y, Koval A, Hallas C i wsp. Tcl1 enhances Akt kinase activity and mediates its nuclear
translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 3028-33.
25. Min YH, Cheong JW, Kim JY i wsp. Cytoplasmic mislocalization of p27Kip1 protein is associated with constitutive phosphorylation of Akt or protein kinase B and poor prognosis in acute myelogenous leukemia. Cancer Res. 2004; 64: 5225-31.
26. Kanamori Y, Kigawa J, Itamochi H i wsp. Correlation between Loss of PTEN Expression and Akt
Phosphorylation in Endometrial Carcinoma. Clin Cancer Res. 2001; 7: 892-5.
27. Kurose K, Zhou XP, Araki T i wsp. Frequent loss of PTEN expression is linked to elevated phosphorylated Akt levels, but not associated with p27 and cyclin D1 expression, in primary epithelial ovarian
carcinomas. Am J Pathol. 2001; 158: 2097-106.
28. Sarbassov DD, Guertin DA, Ali SM i wsp. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science. 2005; 307: 1098-101.
29. Smolewski P, Cebula B, Jamroziak K i wsp. Rapamycin renders acute lymphoblastic leukemia
cells susceptible to apoptosis induced by cladribine while protecting normal lymphocytes: a rationale for
the cyclotherapy concept. Acta Haematol Pol 2006; 37: 553-66.
30. Du L, Smolewski P, Bedner E i wsp. Selective protection of mitogenically stimulated human
lymphocytes but not leukemic cells from cytosine arabinoside-induced apoptosis by LY294002, a phosphoinositol-3 kinase inhibitor. Int J Oncol 2001; 19: 811-19.
31. Tallman MS. New strategies for the treatment of acute myeloid leukemia including antibodies and
other novel agents. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program) 2005: 143-150.
32. Smolewski P., Darzynkiewicz Z, Robak T. Caspase-mediated cell death in hematological malignancies: theoretical considerations, methods of assessment, and clinical implications. Leuk Lymphoma.
2003; 44: 1089-1104.
33. Smolewski P, Szmigielska-Kaplon A, Cebula B i wsp. Proapoptotic activity of alemtuzumab
alone and in combination with rituximab or purine nucleoside analogues in chronic lymphocytic leukemia
cells.: Leuk Lymphoma. 2005; 46: 87-100.
Praca wpłynęła do Redakcji 12.09.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 14.11.2007 r.
Adres do korespondencji:
Prof. dr hab. n. med. Piotr Smolewski
Katedra i Klinika Hematologii UM w Łodzi
Wojewódzki szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika
Ul. Ciołkowskiego 2, 93-510 Łódź
Tel: 42-6895191, 42-689-50-59, 42-689-55-83
Fax: 42-6895192
e-mail: [email protected]