Ćwiczenie

Ćwiczenie
CHARAKTERYSTYKA SPEKTRALNA NAD+ I NADH +H+.
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW Z KLASY OKSYDOREDUKTAZ
Zagadnienia do opracowania:
1. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów wg. Międzynarodowej Unii Biochemicznej.
Charakterystyka poszczególnych klas enzymatycznych.
2. Podział oksydoreduktaz na grupy.
3. Holoenzym, apoenzym, koenzym, grupa prostetyczna, kofaktor - definicje pojęć, funkcje w katalizie,
centrum aktywne.
4. Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej.
5. Definicje jednostek aktywności enzymatycznej.
6. Inhibicja aktywności enzymatycznej – inhibicja odwracalna (kompetycyjna, niekompetycyjna) i
nieowracalna.
7. Koenzymy nikotynamidoadeninowe – pochodne witaminy PP (niacyny, kwasu nikotynowego) - budowa
chemiczna, funkcja biochemiczna, przykłady reakcji.
8. Koenzymy flawinowe – pochodne witaminy B2 (ryboflawiny) - budowa chemiczna, funkcja
biochemiczna, przykłady reakcji.
I. CHARAKTERYSTYKA SPEKTRALNA NAD+ I NADH +H+
Aktywność dehydrogenaz związanych z NAD+, które odbierają elektrony substratom, można obserwować
spektrofotometrycznie. Podczas redukcji pojawia się dodatkowe pasmo absorpcji NADH przy 340 nm, będące
następstwem redukcji aromatycznego pierścienia pirydynowego.
Widma absorpcyjne NAD+ i NADH
Wykonanie
Zmierzyć widmo absorpcyjne roztworów NAD+ i NADH w zakresie od 240 do 400 nm.
Sprawozdanie
Na otrzymanym widmie wyznaczyć długości fali, przy której obserwuje się maksimum absorpcji ( max) dla
obydwu form powyższego koenzymu.
1
II. OZNACZANIE
AKTYWNOŚCI
DEHYDROGENAZY
BURSZTYNIANOWEJ
ZA
POMOCĄ K3[FE(CN)6] ORAZ HAMOWANIE JEJ AKTYWNOŚCI W OBECNOŚCI
INHIBITORÓW.
Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną ściśle związaną z wewnętrzną błoną mitochondrialną.
Katalizuje reakcję cyklu Krebsa podczas której dochodzi do utlenienia bursztynianu do fumaranu oraz uczestniczy
w transporcie protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym. W fizjologicznych warunkach powstałe w reakcji
protony i elektrony są następnie przekazywane na wchodzący w skład łańcucha oddechowego ubichinon.
Zasada metody:
Dehydrogenaza bursztynanowa (SDH) katalizuje reakcję utleniania bursztynianu do fumaranu:
Bursztynian
Fumaran
W oznaczeniach aktywności enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej in vitro stosowane są sztuczne
akceptory elektronów takie jak heksacyjanożelazian (III) potasu - K3[Fe(CN)6]. Powstałe w wyniku reakcji
katalizowanej przez SDH elektrony redukują żółty heksacyjanożelazian (III) potasu
do bezbarwnego
heksacyjanożelazianu (II) potasu wg reakcji przedstawionej poniżej:
K3[Fe(CN)6] + e
żółty

K4[Fe(CN)6]
bezbarwny
Aktywność dehydrogenazy bursztynianowej jest proporcjonalna do stopnia redukcji K3[Fe(CN)6], a więc spadku
absorbancji roztworu przy  = 420 nm. Obserwując zmianę barwy (wartości absorbancji) w trakcie reakcji, można
wnioskować o kierunku przebiegu reakcji oksydacyjno-redukcyjnej w badanym roztworze.
Część analityczna
1) Przygotować mieszaniny inkubacyjne na podstawie zamieszczonej tabeli (objętości podano w ml).
Numer próbówki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,05 M bursztynian sodowy
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
2,0
2,0
0,1
0,1
2,0
2,0
0,05 M malonian sodowy
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0
0
0
0
0,01 M HgCl2
0
0
0
0
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,5%K3[Fe(CN)6]
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
10% kwas trichlorooctowy
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Woda destylowana
3,0
2,9
2,9
2,9
2,8
2,8
0,9
0,9
2,8
2,8
0,9
0,9
0,1 M bufor fosforanowy, pH=6,0
2
2) Wszystkie mieszaniny inkubacyjne należy ogrzewać na łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 5 minut w
celu preinkubacji.
3) Do każdej próbówki dodać 0,5 ml homogenatu wątroby, wymieszać i inkubować przez 30 minut
w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Uwaga: Próbę kontrolną bez substratu będzie stanowiła mieszanina inkubacyjna w próbówce nr 1.
Natomiast w próbówce nr 2 będzie się znajdować próba kontrolna bez aktywnego enzymu, gdyż
obecny w niej kwas trichlorooctowy powoduje denaturację białek, a tym samym zanik ich
aktywności enzymatycznej.
4) Przerwać reakcję enzymatyczną poprzez dodanie 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego do każdej próbówki
(za wyjątkiem próbówki nr 2).
5) Przelać roztwory badane do próbówek plastikowych i odwirować (7000 RPMI, 3 minuty).
6) Zmierzyć absorbancję poszczególnych roztworów przy długości fali 420 nm względem wody.
Sprawozdanie
B. OBLICZENIE STĘŻEŃ MOLOWYCH BURSZTYNIANU I MALONIANU W
POSZCZEGÓLNYCH PRÓBACH BADANYCH
3
C. WYNIKI POMIARU ABSORBANCJI I OBSERWACJE
Numer
próbówki
Cbursztynianu
[mol/dm3]
Cinhibitora
[mol/dm3]
A
Obserwacje
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
D. WNIOSKI
4
III.
BADANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW Z KLASY OKSYDOREDUKTAZ.
A. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY
Katalazy, obecne we wszystkich organizmach tlenowych, są metaloproteinami zawierającymi w swojej
cząsteczce żelazo. Katalizują rozkład H2O2 do wody i tlenu cząsteczkowego. Jest to szczególny przypadek
reakcji hydroperoksydazowej, w której H2O2 jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru.
2H2O2 → 2H2O + O2
ZASADA WYKRYWANIA KATALAZY
Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H2O2 katalizowanej przez katalazę wydzielając się
z roztworu powoduje jego silne pienienie.
WYKONANIE
Do trzech probówek wprowadzić po 2 ml :
a - ekstraktu z ziemniaka
b - zagotowanego ekstraktu z ziemniaka
c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu KCN.
Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki
tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.
B. WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ
Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu- lub czteroelektronową
redukcję cząsteczki tlenu. Produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy jest woda lub nadtlenek
wodoru. Substratem w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole. Produktami reakcji są chinony,
które następnie kondensują tworząc barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą
polifenolową, tyrozynazą lub katecholazą, jest metaloproteiną zawierającą miedź, która przyjmuje
elektrony od difenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy.
ZASADA WYKRYWANIA OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ
Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne
zabarwienie.
5
WYKONANIE
Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny
i roztworu KCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie zdenaturowane białka.
Zawartość wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze
pokojowej. Uwaga: W celu lepszego dostępu tlenu, próby od 1-4 co pewien czas wstrząsnąć, nie
ruszać natomiast próbówki nr 5!!!!. Po 20 min zanotować wyniki reakcji.
Próba
nr
1
2
3
4
5
Wyciąg
(ml)
1
1
1
1
1
Woda
(ml)
0
5 kropli
0
0
0
Bufor pH 7,4
(ml)
1
1
1
1
1
KCN
0
0
2 krople
0
0
Pirokatechina
(ml)
5 kropli
0
5 kropli
5 kropli
5 kropli
Sprawozdanie
Zapisać obserwacje. Zaznaczyć, w których próbówkach zaszła reakcja enzymatyczna. Zapisać
wnioski z eksperymentów.
6