dr hab. Grzegorz Litwinienko, prof. UW Uniwersytet Warszawski

dr hab. Grzegorz Litwinienko, prof. UW
Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii
Pasteura 1
02-093 Warszawa
tel. 22 55 26 300
e-mail: [email protected]
Warszawa 09/04/2016
Recenzja rozprawy doktorskiej Pani magister Anny Zagożdżon pt.
Development of the Taylor dispersion method for diffusion coefficient measurements
Samorzutne przemieszczanie się cząsteczek w przestrzeni na skutek różnicy stężeń to
zjawisko fizyczne o fundamentalnym znaczeniu we wszystkich procesach chemicznych.
Zarówno w nano- i mikroskali stosowanej w laboratoriach chemicznych, analitycznych
i fizykochemicznych jak i w wielkoskalowych procesach przemysłowych, np. szybkość
procesu przebiegającego na katalizatorze kontaktowym (heterogenicznym) zależna jest od
czasu transportu cząsteczek reagentów z głębi fazy ciekłej lub gazowej do powierzchni
katalizatora, gdzie następuje adsorpcja, reakcja właściwa, desorpcja a następnie
oddyfundowanie cząsteczek produktu, co sprawia że powierzchnia katalizatora (lub
biokatalizatora) jest gotowa do przeprowadzenia następnego elementarnego aktu
chemicznego z udziałem substratów. Na tym prostym, szkolnym przykładzie widać, jak
bardzo procesy transportu przebiegające w nano- i w mikroskali są sprzężone
z obserwowanymi w laboratoriach i wykorzystywanymi w przemyśle procesami
makroskalowymi a nawet wielkotonażowymi, z których najbardziej sztandarowe to np.
produkcja amoniaku i azotowych nawozów sztucznych, kraking katalityczny i produkcja
polimerów, gdzie skala produkcji to miliony ton. Na drugim końcu tych przykładów
wymienić należy obszar chemii analitycznej ze szczególnym uwzględnieniem technik
analitycznych opartych na separacji i identyfikacji rozseparowanych substancji, tak jak to ma
miejsce w metodach chromatograficznych, w elektroforezie, oraz we wstrzykowej analizie
przepływowej (Flow Injection Analysis). Wspomniane powyżej zjawiska transportu i sorpcji,
choć tak fundamentalne i intensywnie badane od ponad stu pięćdziesięciu lat, nadal są
opisywane zależnościami empirycznymi - teoretyczne metody obliczeniowe ciągle jeszcze są
niedoskonałe a czasami wręcz bezradne wobec opisu dynamiki zjawisk wynikających
z istnienia w jednym układzie wielkiej liczby cząsteczek różnych substancji, czyli wobec
dyfuzji, lepkości, charakteru przepływu płynu, adsorpcji, transportu przez granicę faz.
W chemii analitycznej, gdzie metody przepływowe i kapilarne są powszechnie stosowane,
dyfuzja reagentów lub analitu wpływa na otrzymany sygnał analityczny, który jest zależny od
dyspersji przepływających substancji zarówno podczas reakcji jak i w drodze do detektora.
Z drugiej strony, na podstawie pomiarów współczynników dyfuzji można wnioskować o
rozmiarach cząsteczek i nanocząstek, dlatego celem projektu doktorskiego podjętego przez
Panią mgr Annę Zagożdżon było udoskonalenie jednej z metod pomiaru współczynników
dyfuzji, a mianowicie metody dyspersji Taylora. Rozprawa doktorska Pani mgr Anny
Zagożdżon zatytułowana Development of the Taylor dispersion method for diffusion
coefficient measurements (Udoskonalenie metody dyspersji Taylora w zastosowaniu do
1
pomiarów współczynników dyfuzji) złożona została przed Radą Naukową Instytutu Chemii
Fizycznej PAN a promotorami są prof. dr hab. Robert Hołyst z IChF PAN oraz dr hab.
Renata Małgorzata Gadzała-Kopciuch z UMK w Toruniu . Projekt doktorski wykonywany
był w ramach Międzynarodowych Studiów Doktoranckich w IChF PAN. Tekst napisany jest
w języku angielskim.
Praca o objętości 97 ponumerowanych stron ma klasyczną kompozycję, po spisie treści
następuje lista notacji i skrótów stosowanych w tekście, jednostronicowe streszczenie, część
literaturowa, w której pierwsze 13 stron (od 17 do 29) to wprowadzenie. Doktorantka
w bardzo skrócony sposób zaprezentowała przykłady czterech metod pomiarowych
stosowanych do wyznaczania współczynników dyfuzji. Rozdział ten jest elementem
technicznym – w części eksperymentalnej pracy Doktorantka nie odniosła się do tych
metod, nie porównała ich z metodą zaproponowaną przez siebie, ani nie stosowała żadnej
z tych czterech metod do weryfikacji rezultatów badań (wyjątkiem jest DLS, stosowane do
trzech pomiarów denaturacji białek w rozdz. 4.4.4). Opis czterech metod wraz z ich zaletami,
wadami i ograniczeniami kończy półstronicowe, bardzo ogólne rozważanie (1.4. Method
selection) o kryteriach doboru poszczególnych metod uwzględniających specyfikę danego
układu, właściwości substancji, wielkość i stężenie próbki. Skoro projekt doktorski dotyczy
zupełnie innej metody, tym bardziej należałoby przeprowadzić podobne dywagacje dla tej
metody i uzasadnić, czemu metoda dyspersji Taylora (stosowana tylko w układach
przepływowych kapilarnych) jest obiektem zainteresowania, naświetlić jej wady i zalety w
porównaniu z czterema omówionymi w Introduction.
Podrozdział zatytułowany Literature review obejmuje 11 stron (30-41) i poświęcony jest
istocie zjawiska, wraz z matematycznym opisem metody dyspersji Taylora, warunkom
(charakter przepływu, czynniki geometryczne, objętość próbki). Omówiono także zjawisko
powstawania wirów (przepływ wtórny) towarzyszące przepływowi cieczy przez kapilary
zwinięte spiralnie. Podrozdział ten kończy się sekcją zatytułowaną Challenges of determining
the diffusion coefficient by the Taylor dispersion analysis, w którym Autorka zawarła wykaz
trudności i sprzeczności jakie pojawiać się mogą podczas prób optymalizacji parametrów
analizy takich jak wymiary kapilary, prędkość przepływu, czas analizy. W tym miejscu
sformułowano cel pracy jako zbadanie procesów dyspersyjnych zachodzących w zwiniętej
kapilarze w której faza nośna porusza się z relatywnie dużą prędkością.
Część eksperymentalną rozpoczyna opis metodologii, odczynników i aparatury
zamieszony na 4 stronach (str. od 45 do 48). Opis układu badawczego: metodologia
wyznaczania przekroju kapilary, kalibracja instrumentu nie wzbudza zastrzeżeń, jednak
procedura dopasowania danych eksperymentalnych do równania 2.27, opisującego rozkład
stężeń, został zilustrowany tylko jednym przykładem – nie ma informacji czy próby takie
prowadzono dla innych substancji oraz dla innych, zmienionych parametrów aparaturowych.
Wyniki i ich dyskusja umieszczone są w rozdziale 4, na 35 stronach (od 49 do 84). Pracę
eksperymentalną rozpoczęto od walidacji metody. Badano wpływ szybkości przepływu
(laminarnego), objętości próbki, długości kapilary na współczynnik rozproszenia. Następnie
Doktorantka sprecyzowała cel badań i dla szybkich przepływów zaproponowała rozwiązanie
(równania 4.1 i 4.2) będące tezą doktorską. Słuszność tego rozwiązania została
zweryfikowana: wartości współczynników dyfuzji wyznaczone dla rybonukleazy, lizozymu
i azotanu (V) potasu były zgodne z danymi literaturowymi. Pozostała część Rozdz. 4
poświęcona jest zastosowaniu zaproponowanej, udoskonalonej metody dyspersji Taylora do
układów biochemicznych. W tym miejscu brakuje mi dogłębnego, szczegółowego
uzasadnienia obiektów badań. Najlepszym miejscem do przeprowadzenia takiego
uzasadnienia byłby wstęp do części eksperymentalnej, w którym Doktorantka mogłaby opisać
założenia swoich tez doktorskich, wyjaśnić ideę weryfikacji tych założeń i sposób doboru
obiektów badań. Jednak ani tu, ani w rozdziałach prezentujących i dyskutujących wyniki
2
badań czytelnik nie dowiaduje się czy badano przypadkowe czy nieprzypadkowe serie
związków? Czy peptydy zostały dobrane w taki sposób, aby obserwować nie tylko różnice w
rozmiarze cząsteczek czy ich przekroju hydrodynamicznym ale również ładunku,
hydrofobowości, zawartości aminokwasów aromatycznych, itp.? Przykładowo, opis
rezultatów pomiarów prowadzonych dla serii 11 peptydów mieści się na jednej stronie (str.
61) i zawiera Tabelę z ich masami cząsteczkowymi, współczynnikami dyfuzji, oraz
obliczonymi z tych współczynników przekrojami hydrodynamicznymi. Trudno doszukać się
tu elementów dyskusji otrzymanych wyników, krytycznego omówienia jakie czynniki
wpływają a jakie nie wpływają na wielkość wyznaczonych wartości D. Nie porównano
wartości otrzymanych metodą dyspersji Taylora z wartościami uzyskanymi innymi metodami.
Rozdział 4.2.2 prezentuje Tabelę z wyznaczonymi współczynnikami dyfuzji substancji
o działaniu farmakologicznym. W kilkuzdaniowym wstępie Doktorantka przedstawia
motywację, oraz informuje że literatura dotycząca dyfuzji cząsteczek o działaniu leczniczym
jest bardzo ograniczona, dlatego postanowiła wyznaczyć współczynniki dyfuzji dla 10 takich
substancji a ponadto 20 substancji o potencjalnym działaniu antypsychotycznym
(neurolepptyków). Wyniki zawarte w tabelach 4.8 i 4.9 nie są przedyskutowane,
eksperymentalnie wyznaczone wartości współczynników D dla znanych farmaceutyków nie
są zestawione z wartościami literaturowymi. Ze sformułowania: „limited number of data
concerning diffusivity of drugs in the literature” nie wynika, że takich danych nie ma w ogóle
- byłoby to dziwne, jeśli chodzi o np. ibuprofen i inne popularne lekarstwa zamieszczone w
tabeli 4.8. Nawet jeśli dane takie są niedostępne, należałoby przedyskutować / skomentować
otrzymane wartości. W obecnym stanie rozdział 4.3.2 przypomina raport techniczny
z wykonanej serii pomiarów dla przypadkowych związków. Ponadto, skoro jak Autorka
zapewnia we wstępie do tej sekcji, wiedza o współczynnikach dyfuzji farmaceutyków jest
kluczowa to zrozumienia procesów, w których te substancje biorą udział, to dobrze byłoby
pod Tabelą 4.9 zamieścić krótką notatkę, czy wyznaczone wartości korelują z aktywnością
lub z farmakokinetyką tych substancji. Nawet jeśli takie badania nie zostały zrobione przez
grupę z WUM, Doktorantka mogła zamieścić uproszczoną dyskusję wiążącą wyznaczone
współczynniki dyfuzji substancji 1-20 z ich strukturą. Czy istnieje taki związek?
Podobnie jak dla peptydów, klucz wyboru białek również nie został opisany w sposób
satysfakcjonujący. Rozdział 4.4 to opis badań denaturacji białek pod wpływem surfaktantów
(liczba mnoga jest tu nieuzasadniona, ponieważ używano tylko jednego surfaktanta
syntetycznego, SDS) . Rozdział ten rozpoczyna wstęp zawierający ogólne informacje
o białkach, o rzędowości struktury białek oraz o surfaktantach (definicja, podział i definicja
CMC i opis struktur micelarnych tworzonych przez surfaktanty). Nie wyjaśniono dlaczego
badano takie a nie inne białka, dlaczego zdecydowano się na surfaktant anionowy. Wyniki
tych badań zakończyły się powodzeniem – stosowana przez Doktorantkę metoda pozwala
wyznaczyć zmiany współczynnika dyfuzji wywołane denaturacją białka, gdy przekroczone
jest pewne minimalne stężenie SDS. Rezultaty te są zgodne z wynikami pomiarów
prowadzonych przez Doktorantkę metodami komplementarnymi (rezultaty badań metodą
dichroizmu kołowego oraz metodą dynamicznego rozpraszania światła DLS, opisane
odpowiednio, w rozdz. 4.4.3 i 4.4.4.).
Rozdział 4.3.3 poświęcony jest prezentacji współczynników dyfuzji wyznaczonych dla
fragmentów nici DNA o strukturze spinki do włosów (tzw. spinek DNA). Dwie badane,
komercyjnie dostępne spinki DNA wykazywały podobne współczynniki dyfuzji. Pomiary
prowadzono dla kilku prędkości przepływu przez kapilarę, lecz nie uzyskano
satysfakcjonującego rezultatu w postaci zróżnicowania obydwu obiektów. Szkoda że nie
porównano otrzymanych wyników z wartościami zmierzonymi inną metodą. Obserwację, że
dla malejącej prędkości przepływu współczynnik D wzrasta, wytłumaczono tworzeniem
wiązań wodorowych podczas powolnego przepływu (wg Doktorantki spinki DNA mają
3
wtedy więcej czasu na utworzenie wiązań wodorowych). Jednak tworzenie wiązań
wodorowych jest procesem ultraszybkim i tłumaczenie takie jest mało prawdopodobne.
Wnioski końcowe zajmują 4 strony a całość kończy spis cytowanej literatury składający
się ze 117 pozycji.
Za największe osiągnięcie projektu doktorskiego uważam zaproponowanie ulepszonej
metody dyspersji Taylora, pozwalającej na prowadzenie pomiarów przy znacznie większych
prędkościach przepływu przez kapilarę. Nowa, ulepszona metoda pozwala na skrócenie czasu
wykonywania pomiarów przy zachowaniu dobrej a nawet wyższej dokładności . Jest to
bezsprzeczny atut przedstawionej pracy doktorskiej Pani mgr Anny Zagożdżon. Jednak
autorce zabrakło energii lub czasu na poszerzoną dyskusję otrzymanych wyników,
konfrontację wyznaczonych eksperymentalnie współczynników dyfuzji z wartościami
literaturowymi lub z wartościami wyznaczonymi innymi metodami, np. metodami opisanym
we wstępie do części literaturowej, co sprawia, że czasem sposób prezentacji wyników jest
typowy dla ekspertyzy, z pominięciem elementów typowych dla rozprawy doktorskiej, jakimi
są poszukiwanie współzależności i mechanizmów badanych zjawisk oraz warunkujących je
czynników, dokonywanie uogólnień, weryfikacja różnymi metodami, krytyczne spojrzenie na
uzyskane wyniki, poszerzona analiza błedów, itp.. Pod tym względem najlepiej prezentuje się
rozdział dotyczący denaturacji białek, gdzie porównano i przedyskutowano wyniki
otrzymane zaproponowaną metodą z wynikami uzyskanymi dwiema innymi technikami.
Język jakim napisana jest praca jest poprawny, zgodny z raportami naukowymi.
Doktorantce zdarzają się nieliczne potknięcia językowe związane ze stosowaniem polskiej
składni przetłumaczonej literalnie na język angielski oraz kilka błędów związanych ze
specyfiką słownictwa naukowego, np. liczba mnoga rzeczownika radius raz występuje w
wersji poprawnej, nieregularnej jako „[hydrodynamic] radii” (str 61) a innym razem w
wersji niepoprawnej, ale ostatnio coraz częściej stosowanej: „radiuses” (w nagłówku do
Tabeli 3.2 na str. 48). Na stronie 72. Doktorantka wprowadza podział sufraktantów na
„anionic, cationic, amphoteric and neutral” lecz zamiast „amphoteric” bardziej
jednoznacznym i poprawnym określeniem surfaktantów obojnaczych jest zwitter-ionic.
Podsumowując, stwierdzam, że podjęty przez Doktorantkę temat jest ważny
z teoretycznego i praktycznego punktu widzenia, a sposób w jaki sformułowano
i uzasadniono przedmiot badań jest poprawny. Doktorantka zna literaturę przedmiotu i
potrafi ją twórczo wykorzystać. Efektem badań jest zaproponowanie rozwiązania problemu
badawczego jakim jest zwiększenie dokładności pomiarów prowadzonych w
zmodyfikowanych warunkach i skrócenie czasu analizy. Zaproponowane rozwiązanie
poddane zostało empirycznej weryfikacji w sposób metodologicznie poprawny. Dodatkową,
ale niezwykle istotną miarą merytorycznej wartości pracy jest fakt, że część wyników została
opublikowana w dwóch doskonałych czasopismach naukowych z dziedziny chemii
analitycznej: w Analytical Chemistry 2013, 85, 4051-4056 oraz w Analitica Chimica Acta
2015, 855, 51-59. Ponadto, przedstawione rozwiązanie jest przedmiotem dwóch postępowań
patentowych (P-220250 oraz P-407087).
Rozprawa spełnia wymagania określone w art. 13 ustawy z dn. 14 marca 2003 roku
o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U.
Nr 65/2003 poz. 595 z późniejszymi zmianami), dlatego wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr
Anny Zagożdżon do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
4