Artykuł naukowy

Znaczenie i zastosowanie dysmutazy ponadtlenkowej
Jacek Wawrzykowski
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Katedra Biochemii i Fizjologii Zwierząt,
Zakład Biochemii, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin, [email protected]
Streszczenie
Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD, EC 1.15.1.1) jest pierwszym wyizolowanym i opisanym
metaloenzymem. Jednak wciąż trwają prace nad poznaniem jej roli w żywym organizmie. Mnogość
izoform SOD pozwala twierdzić iż enzym ten występuje niemal w każdym żywym organizmie. W pracy
opisano budowę i właściwości rożnych form dysmutazy ponadtlenkowej. Przedstawiono też wybrane
zastosowania SOD w próbach leczenia schorzeń wywołanych obecnością wolnych rodników w żywych
organizmach.
Dysmutaza ponadtlenkowa
Dysmutaza ponadtlenkowa to rodzina enzymów katalizujących reakcję dysmutacji rodnika ponadtlenkowego
do nadtlenku wodoru (1), ogólnie reakcję ta można zapisać jako:
O2*- + O2*- + 2H+ -> H2O2 + O2
W organizmach żywych stwierdzono obecność trzech izoform SOD. W cytoplazmie zwierząt i grzybów
występuje dimeryczna postać CuZnSOD (SOD1), w mitochondriach terameryczna MnSOD (SOD2) oraz
zewnątrzkomórkowa forma tetrameryczna CuZnSOD (EC-SOD, SOD 3). Każda z tych metaloprotein katalizuje ta
samą reakcję jednak kodowane są przez różne geny oraz posiadają różne struktury. Głównie u bakterii i roślin
można jeszcze spotkać tetrameryczna lub dimeryczną postać FeSOD lub NiSOD.
Budowa
W organizmach eukariotycznych CuZnSOD występuje w formie dimerycznej. Zbudowana jest z dwóch
jednakowych podjednostek o masie 16 kDa każda. Battistoni i wsp. podają że CuZnSOD pochodząca z E.coli
występuje w postaci monomeru (2). W każdej z podjednostek znajduje się jeden jon Cu2+oraz jeden jon Zn2+.
Jony miedzi związane są z resztami histydyny w pozycjach 44, 46, 61oraz 118, jony cynku wiązane są przez reszty
histydyny 61, 69, 78 i kwas asparaginowy 81 (3).
MnSOD i FeSOD występują w organizmach prokariotycznych w postaci dimeru, również mitochondrialna
MnSOD, w komórkach eukariotycznych, występuje pod postacią dimeru (4, 5). Opisane są też formy
tetrameryczne (otrzymane w drodze krystalizacji z roztworu) występujące u bakterii termofilnych (6, 7). W
mitochondrium komórek eukariotycznych występuje tetrameryczne MnSOD, która jest syntetyzowana w
cytozolu na podstawie kodu zapisanego w jądrze komórkowym. Pierwszorzędowa sekwencja mitochondrialnej
MnSOD wykazuje dużą homologię z sekwencją Mn- i FeSOD pochodzenia prokariotycznego, jednak w znacznym
stopniu różni się od sekwencji CuZnSOD (8). W przypadku MnSOD jak i FeSOD jon metalu (odpowiednio mangan
lub żelaza) koordynowany jest przez trzy histydyny (26, 74, 163) i kwas asparaginowy (159) (9).
Zewnątrzkomórkowa dysmutaza ponadtlenkowa EC-SOD to glikoproteina składająca się z czterech
identycznych podjednostek (u niektórych gatunków jest to dimer), a każda zawiera atom miedzi i cynku. W
komórkach ssaków EC-SOD występuje w postaci dimeru o masie 135 kDa (10, 11).Due i wsp. donoszą też o
istnieniu formy oktameru (12). Podjednostki zbudowane są z 240 aminokwasów, mimo różnej sekwencji
aminokwasów budowa miejsca aktywnego jest zbliżona do CuZnSOD (13). Tainer i wsp. wykazali 50%
podobieństwo sekwencji aminokwasów budujących EC-SOD i CuZnSOD (14).
Rys. 1.Porównanie sekwencji dysmutazy ponadtlenkowej SOD1 (CuZNSOD, Human, P00441) oraz SOD3 (EC-SOD, Human, P08294)
za pomocą programu CLUSTAL W2. * -oznacza inwentyczny aminokwas, : - aminokwas podobny, . – aminokwas o zbliżonej
budowie, - - przerwa. Sekwencje białek pochodzą ze strony http://www.uniprot.org/, program CUSTAL W2 dostępny jest na stronie
http://www.ebi.ac.uk/ .
W komórkach bakteryjnych występuje też forma NiSOD, homotetramer zbudowany z dwu podjednostek o
masie 13 i 22 kDa zawierających atom niklu (15).
Właściwości
CuZnSOD jest białkiem charakteryzującym się wysoką odpornością na działanie podwyższonej temperatury,
trudno ulega proteolizie oraz działaniu środków denaturujących białko (takich jak siarczan dodecylu, chlorek
guanidyny czy roztwory mocznika), zachowuje też stabilność w szerokim zakresie pH. Badania nad CuZnSOD
pochodzącym z E.coli wykazały jednak niską odporność enzymu na działanie enzymów proteolitycznych (16).
Jednak aktywność CuZnSOD jest hamowana przez azydki, ditiokarb,cyjanki, nadtlenek wodoru.
EC-SOD, podobnie jak CuZnSOD wykazuje stabilność w wysokich temperaturach, szerokim zakresie pH i przy
wysokich stężeniach mocznika. Jednak jej aktywność jest hamowana przez te same inhibitory podobnie jak
CuZnSOD (17).
MnSOD jest mniej odporna na działanie czynników chemicznych, nie ulega jednak inhibicji przez cyjanki,
ditiokarb i nadtlenek wodoru.
FeSOD podobnie jak MnSOD wykazuje mniejszą odporność na działanie czynników fizycznych. W
przeciwieństwie do wcześniej opisanych izoform SOD jej działanie natomiast inhibituje jedynie obecność
nadtlenku wodoru.
Mechanizm działania
SOD katalizuję reakcję dysmutacji ponadrodnika tlenowego do nadtlenku wodoru i cząsteczki tlenu. W
przypadku CuZnSOD przebieg reakcji można zapisać równaniem:
E-Cu2+ + O2*- + H+ -> E’-Cu+ + O2
E’-Cu2+ + O2*- + H+ -> E-Cu2+ + H2O2
W sumie:
2 O2*- + 2 H+ -> O2 + H2O2
Sumaryczna stała szybkości tej reakcji wynosi 2,3x109M-1s-1 (18).
W przypadku MnSOD oraz FeSODreakcję można zapisać jako:
Mn3+ + O2*- -> Mn2+ + O2
Mn2+ + O2*- + 2 H+ -> Mn3+ + H2O2
i odpowiednio
Fe3+ + O2*- -> Fe2+ + O2
Fe2+ + O2*-+ 2 H+ -> Fe3+ + H2O2
Stała szybkości reakcji katalizowanej przez FeSOD oraz MnSOD są mniejsze od CuZnSOD, z wartościami
kcat/KM odpowiednio 3x108 M-1s-1 i 5,6x108 M-1s-1,natomiast dla NiSOD stała szybkości reakcji jest zbliżona do
wartości dla CuZnSOD i kształtuje się na poziomie na poziomie ~109 M-1s-1(9, 19).
Inne funkcje SOD
Oprócz katalizowania reakcji dysmutacji, SOD wykazuje aktywność enzymatyczną też w przypadku innych
substratów. Wykazano katalityczną aktywność CuZnSOD w usuwaniu tlenu singletowego. Ma to ogromne
znacznie ponieważ dotychczas nie wykryto żadnego innego enzymu mogącego usuwać tlen singletowy. Reakcja
opiera się na utlenianiu reszt histydyny, tyrozyny i metioniny obecnych w cząsteczce enzymu. Udowodniono że
CuZnSOD jest w stanie utleniać wiele substratów takich jak azotyny, DMPO, tyrozynę, ABTS. Opisano udział
CuZnSOD aktywowanej nadtlenkiem wodoru w reakcji przekształcania jonu wodorowęglanowego do anionorodnika węglanowego. W większości z tych reakcji produktem jest wolny rodnik który może prowadzić do
uszkodzeń wewnątrz komórek (20).
Zastosowanie SOD
W literaturze można spotkać szereg doniesień o korzystnych efektach terapii z zastosowaniem SOD, które
zostały przebadane na zwierzętach jak i w trakcie prób klinicznych u ludzi. Podejmowano pozytywnie
zakończone próby zastosowania SOD w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości, zapaleniu
pęcherza (poradiacyjnego), zapalenia jelit (choroba Crohna) czy nawet tocznia rumieniowatego (21, 22).
Conor i wsp. wykazali że obecność SOD (i katalazy) w płynie perfuzyjnym w przypadku ortotopowego
przeszczepu wątroby u szczurów zwiększa przeżywalność przeszczepów ???(może lepiej – przeciwdziałała
odrzucaniu przeszczepów?)(23).
Zastosowanie SOD jako leku napotyka na wiele problemów. SOD jest białkiem, a więc w przewodzie
pokarmowym ulega proteolizie. Z drugiej strony ze względu na małą masę cząsteczkową okres półtrwania we
krwi po podaniu dożylnym zwierzętom doświadczalnym wynosi poniżej 10 minut (24, 25).
Aby zwiększyć okres półtrwania enzymu w krwiobiegu stosuje się kilka technik. Najprostsza z nich polega na
sprzęganiu białka enzymatycznego z polimerami lub z innym białkiem enzymatycznym. Zapobiega to wydalaniu
enzymu przez nerki, ale może też modyfikować właściwości enzymu. Koo i wsp. stosowali SOD połączone z
lecytyną do ochrony komórek śródbłonka przed uszkodzeniem wywołanym niedotlenieniem i reperfuzją (26).
Podobne wyniki otrzymali Manson i wsp. (27).Połączenie cząsteczek SOD
z katalazą za pomocą
dialdehyduglutarowego lub dekstranu zapobiegały uszkodzeniu mięśnia sercowego oraz skutecznie zmniejszały
skutki krzemicy u szczurów. Sprzężenie SOD z katalazą wpływało na wydłużenie czasu półtrwania w krwiobiegu
zwierząt doświadczalnych, oraz zwiększało odporność SOD na inaktywację nadtlenkiem wodoru (28, 29).
Podejmowane są próby wprowadzenie SOD do wnętrza komórek poprzez umieszczenie enzymu wewnątrz
liposomów, zwiększa to okres półtrwania enzymu do kilku godzin. Komórki wchłaniają liposomy wraz z ich
zawartością umożliwia łatwiejsze dotarcie do wnętrza komórki aktywnego enzymu (30, 31, 32, 33).
Podsumowanie
Dysmutaza ponadtlenkowa jest pierwszym wyizolowanym i opisanym metaloenzymem. Wciąż trwają prace
mające na celu zrozumienie mnogości form dysmutazy, ich wzajemnych relacji i znaczenia dla żywego
organizmu. Równolegle pojawiają się próby zastosowania enzymów z klasy dysmutaz w walce z wolnymi
rodnikami i reaktywnymi formami tlenu w trakcie procesów patologicznych zachodzących w żywych
organizmach. Na tym polu odnotowano już pewne sukcesy, a terapia dysmutazą ponadtlenkową nie jest już
tylko czysto akademicką teorią.
Bibliografia
1. Fridovich I, Superoxide Radical and Superoxide Dismutases, Topics in Environmental Physiology and
Medicine, 1981, pp 250-272
2. Battistoni A, Pacello F, Folcarelli S, Ajello M, Donnarumma G, Greco R, Ammendolia MG, Touati D, Rotilio
G, Valenti P, Increased expression of periplasmic Cu,Zn superoxide dismutase enhances survival of
Escherichia coli invasive strains within nonphagocytic cells, Infect Immun, 2000,68(1), pp 30-37
3. Branco R, Fernandes P, Ramos M, Cu, Zn Superoxide dismutase: distorted active site binds substrate
without significant energetic cost, Theoretical Chemistry Accounts, 2006, 115(1), pp 27-31
4. Hunter T, Bannister WH, Hunter GJ, Cloning, expression, and characterization of two manganese
superoxide dismutases from Caenorhabditis elegans, J Biol Chem. 1997, 272(45), pp 28652-28661
5. Trinh CH, Hunter T, Stewart EE, Phillips SE, Hunter GJ, Purification, crystallization and X-ray structures of
the two manganese superoxide dismutases from Caenorhabditis elegans, Acta Crystallogr Sect F Struct
Biol Cryst Commun. 2008, 64(12), pp 1110-1114
6. Sheng Y, Durazo A, Schumacher M, Gralla EB, Cascio D, Cabelli DE, Valentine JS, Tetramerization
Reinforces the Dimer Interface of MnSOD, PLoS One. 2013, 8(5), e62446
7. Nakamura T, Torikai K, Uegaki K, Morita J, Machida K, Suzuki A, Kawata Y, Crystal structure of the
cambialistic superoxide dismutase from Aeropyrum pernix K1 – insights into the enzyme mechanism and
stability, FEBS Journal, 2011, 278(4), pp 598–609
8. Borgstahl GE, Parge HE, Hickey MJ, Beyer WF Jr, Hallewell RA, Tainer JA, The structure of human
mitochondrial manganese superoxide dismutase reveals a novel tetrameric interface of two 4-helix
bundles, Cell. 1992, 71(1), pp 107-18
9. Christianson DW, Structural chemistry and biology of manganese metalloenzymes, Prog Biophys Mol
Biol. 1997, 67(2-3), pp 217-52
10. Rodney J. Folz, James D. Crapo, Extracellular Superoxide Dismutase (SOD3): Tissue-Specific Expression,
Genomic Characterization, and Computer-Assisted Sequence Analysis of the Human EC SOD Gene,
Genomics, 1994, 22(1), pp 162-171
11. Gottfredsen RH, Larsen UG, Enghild JJ, Petersen SV, Hydrogen peroxide induce modifications of human
extracellular superoxide dismutase that results in enzyme inhibition, Redox Biology, 1(1), 2013, pp 24-31
12. Due AV, Petersen SV, Valnickova Z, Østergaard L, Oury TD, Crapo JD, Enghild JJ, Extracellular superoxide
dismutase exists as an octamer, FEBS Letters, 580(5), 2006, pp 1485-148
13. Carlsson LM, Marklund SL, Edlund T, The rat extracellular superoxide dismutase dimer is converted to a
tetramer by the exchange of a single amino acid, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, pp. 5219-5222
14. Tainer JA, Getzoff ED, Beem KM, Richardson JS, Richardson DC, Determination and analysis of the 2 Astructure of copper, zinc superoxide dismutase. J Mol Biol. 1982, 160(2), pp 181-217.
15. Bartosz G, Druga twarz tlenu, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2006, Warszawa
16. Imlay KR, Imlay JA, Cloning and analysis of sodC, encoding the copper-zinc superoxide dismutase of
Escherichia coli, J Bacteriol. 1996, 178(9), pp 2564–2571
17. Tibell L, Aasa R, Marklund SL., Spectral and physical properties of human extracellular superoxide
dismutase: a comparison with CuZn superoxide dismutase, Arch Biochem Biophys. 1993, 304(2), pp 42933
18. Bielski BHJ, Cabelli DE, Arudi RL, Ross AB, Reactivity of HO2/O−2 Radicals in Aqueous Solution, J. Phys.
Chem. Ref. Data, 1985, 14(4), pp 1041-1101
19. Wuerges J, Lee JW, Yim YI, Yim HS, Kang SO, Djinovic Carugo K, Crystal structure of nickel-containing
superoxide dismutase reveals another type of active site, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004, 101(23), pp
8569-8574
20. Bartosz G, Superoxide Dismutases and Catalase, The Handbook of Environmental Chemistry, 2005, 20,
pp 109-149
21. Emerit J, Pelletier S, Likforman J, Pasquier C, Thuillier A, Phase II trial of copper zinc superoxide
dismutase (CuZn SOD) in the treatment of Crohn's disease, Free Radic Res Commun. 1991, 12-13(2), pp
563-571
22. Flohé L, Superoxide dismutase for therapeutic use: clinical experience, dead ends and hopes, Mol Cell
Biochem. 1988, 84(2), pp 123-154
23. Connor HD, Gao W, Nukina S, Lemasters JJ, Mason RP, Thurman RG, Evidence that free radicals are
involved in graft failure following orthotopic liver transplantation in the rat--an electron paramagnetic
resonance spin trapping study, Transplantation, 1992, 54(2), pp 199-204
24. Inoue M, Ebashi I, Watanabe N, Morino Y, Synthesis of a superoxide dismutase derivative that circulates
bound to albumin and accumulates in tissues whose pH is decreased, Biochemistry, 1989, 28 pp 6619–
6624
25. Epperly MW, Kagan VE, Sikora CA, Gretton JE, Defilippi SJ, Bar-Sagi D, Greenberger JS, Manganese
superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) administration protects mice from esophagitis
associated with fractionated radiation, International Journal of Cancer, 2001, 96(4), pp 221–231
26. Koo DD, Welsh KI, West NE, Channon KM, Penington AJ, Roake JA, Morris PJ, Fuggle SV, Endothelial cell
protection against ischemia/reperfusion injury by lecithinized superoxide dismutase, Kidney Int. 2001,
60(2), pp 786-796
27. Manson PN, Anthenelli RM, Im MJ, Bulkley GB, Hoopes JE, The role of oxygen-free radicals in ischemic
tissue injury in island skin flaps, Ann Surg. 1983, 198(1), pp 87–90
28. Mao GD, Thomas PD, Lopaschuk GD, Poznansky MJ, Superoxide dismutase (SOD)-catalase conjugates.
Role of hydrogen peroxide and the Fenton reaction in SOD toxicity, J Biol Chem. 1993, 268(1), pp:41620
29. Maksimenko AV, Bezrukavnikova LM, Grigorieva EL, Yaglov VV, Torchilin VP, Effect of native and
modified forms of superoxide dismutase and catalase on experimental silicosis in rats, Ann N Y Acad Sci.
1992, 672, pp118-125
30. Freeman BA, Young SL, Crapo JD, Liposome-mediated augmentation of superoxide dismutase in
endothelial cells prevents oxygen injury, J Biol Chem, 1983, 258, pp 12534–12542
31. Turrens JF, Crapo JD, Freeman BA, Protection against oxygen toxicity by intravenous injection of
liposome-entrapped catalase and superoxide dismutase, J Clin Invest, 1984, 73, pp 87–95
32. T.M.S. Chang , F. D’Agnillo, W.P. Yu, S. Razack, Two future generations of blood substitutes based on
polyhemoglobin–SOD–catalase and nanoencapsulation, Advanced Drug Delivery Reviews, 2000, 40(3),
pp 213–218
33. Cuzzocrea S, Riley DP, Caputi AP, Salvemini D, Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in
shock, inflammation, and ischemia/reperfusion injury, Pharmacol Rev. 2001, 53(1), pp 135-159