WYMAGANIA AKREDYTACYJNE DLA LABORATORIÓW

JAK WYZNACZYĆ PARAMETRY
WALIDACYJNE W METODACH
INSTRUMENTALNYCH
dr inż. Agnieszka Wiśniewska
„EKOLAB” Sp. z o.o.
[email protected]
DZIAŁALNOŚĆ „EKOLAB” SP. Z O.O.
Akredytowane laboratorium badawcze „Ekolab” Sp. z o.o.
prowadzi następujące badania i pomiary:
1) badania laboratoryjne (wody, ścieków, gleby, osadów
ściekowych, odpadów, próbek powietrza itp.),
2) pomiary środowiska pracy,
3) pomiary emisji zanieczyszczeń,
4) pomiary hałasu w środowisku,
5) pomiary skuteczności wentylacji,
6) badania czystości powietrza,
7) badania sprężonego powietrza.
AKREDYTACJA LABORATORIUM
Akredytacja to uznanie przez jednostkę akredytującą
kompetencji laboratorium do wykonywania
określonych działań.
W przypadku laboratoriów badawczych jest to
uznanie kompetencji do wykonywania
poszczególnych badań.
W Polsce jedyną jednostką akredytacyjną jest Polskie
Centrum Akredytacji (PCA).
Akredytacja jest udzielana przez PCA na wniosek
laboratorium, po dokonaniu jego oceny
i potwierdzeniu, że spełnia określone wymagania.
Ocena dokonywana jest podczas audytu z udziałem
audytorów PCA.
AKREDYTACJA LABORATORIUM
Laboratoria badawcze muszą spełniać
wymagania normy
PN-EN ISO/IEC 17025:2005 Ogólne
wymagania dotyczące kompetencji
laboratoriów badawczych i wzorcujących
AKREDYTACJA LABORATORIUM
Punkt 5 normy przedstawia wymagania techniczne,
jakie powinno spełnić laboratorium badawcze, aby
uzyskać akredytację.
Czynniki wpływające na prawidłowość i wiarygodność
badań:
- czynnik ludzki (personel);
- warunki lokalowe i środowiskowe;
- metody badań oraz ich walidacja;
- wyposażenie;
- spójność pomiarowa;
- pobieranie próbek;
- postępowanie z obiektami badania (badanymi
próbkami).
AKREDYTACJA LABORATORIUM
Metody badań oraz ich walidacja
- stosowanie w laboratorium właściwych metod
znormalizowanych i/lub metod własnych,
- prawidłowe przeprowadzenie walidacji metod
badawczych (procedura walidacji i protokół
z walidacji),
- szacowanie niepewności metod badawczych,
- kontrola jakości wykonywanych badań.
AKREDYTACJA LABORATORIUM
Spójność pomiarowa
- stosowanie certyfikowanych wzorców
i certyfikowanych materiałów odniesienia (CRM),
- opracowanie procedur kalibracji wyposażenia
pomiarowego,
- upoważnienie personelu do przeprowadzania
kalibracji,
- stosowanie wywzorcowanych przyrządów
pomiarowych ze świadectwami wzorcowania,
- zachowanie spójności z jednostkami SI.
WALIDACJA
Walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie
i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały
spełnione szczególne wymagania dotyczące
konkretnie zamierzonego zastosowania.
Walidacja ma zatem na celu sprawdzenie, czy
w warunkach danego laboratorium jesteśmy w stanie
wykonać oznaczenie daną metodą analityczną
z założoną precyzją, dokładnością i niepewnością.
Procedura pomiarowa – szczegółowy opis sposobu
postępowania prowadzącego do przeprowadzenia
pomiarów za pomocą zastosowanej metody
pomiarowej
KIEDY PRZEPROWADZAMY WALIDACJĘ?
Walidacja powinna być przeprowadzona kiedy:
1) opracowujemy nową procedurę analityczną,
2) rozszerzamy zakres już zwalidowanej metodyki
np. zakres oznaczanych stężeń, oznaczenie danego
analitu w innej matrycy,
3) przeprowadzamy porównanie nowej metody
analitycznej z inną znaną i zwalidowaną metodą,
4) stwierdzamy w wyniku kontroli jakości stosowanej
metodyki zmienność jej parametrów walidacyjnych
w czasie,
5) planujemy wykorzystanie danej metodyki w innym
laboratorium, z zastosowaniem innej aparatury, lub
oznaczenia rutynowe za pomocą danej metodyki mają
być wykonywane przez innego analityka.
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO PROCESU WALIDACJI
Przed przystąpieniem do procesu walidacji należy
określić podstawowe cechy procedury analitycznej:
 czy ma to być analiza jakościowa, czy ilościowa;
 rodzaj oznaczanego analitu;
 rodzaj matrycy, w której będzie oznaczany dany
analit;
 poziom i zakres stężeń oznaczanego analitu;
 obecność substancji przeszkadzających
(interferentów) i sposoby ich wyeliminowania;
 istnienie regulacji prawnych lub innych wymogów,
którym powinna sprostać dana procedura
analityczna;
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO PROCESU WALIDACJI






wymagana wartość granicy wykrywalności i granicy
oznaczalności;
wymagany poziom dla precyzji i poprawności
metody;
wymagany zakres stosowania;
wymagana odporność metody;
wymagana aparatura pomiarowa i sprzęt
pomocniczy;
czy istnieje możliwość zastosowania walidowanej
procedury badawczej w innych laboratoriach.
ZAŁOŻENIA WALIDACYJNE
Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga
zastosowania:
• ślepych próbek,
• wzorców (np. roztworów kalibracyjnych, próbek
testowych, gazów wzorcowych, kalibratorów itp.),
• (certyfikowanych) materiałów odniesienia,
• powtórzeń,
• obróbki statystycznej wyników w celu wyznaczenia
niepewności walidowanej metody.
PARAMETRY WALIDACJYJNE
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
precyzja (powtarzalność, precyzja pośrednia,
odtwarzalność),
dokładność,
poprawność,
granica wykrywalności,
granica oznaczalności,
zakres pomiarowy,
liniowość,
selektywność,
odporność,
elastyczność.
PRECYZJA
Precyzja to stopień zgodności pomiędzy niezależnymi
wynikami uzyskanymi w trakcie analizy danej próbki
z zastosowaniem danej procedury analitycznej. Precyzja
jest miarą rozrzutu uzyskanych wyników oznaczeń wokół
wartości średniej.
Miarą precyzji jest odchylenie standardowe średniej lub
względne odchylenie standardowe RSD:
n
Sx 
 xi  x 2
i 1
nn1
RSD 
Sx
 100%
x
gdzie:
n – liczba wykonywanych pomiarów
xi – pojedynczy pomiar
_
x - średnia arytmetyczna z pomiarów
Precyzja wyrażana jest jako powtarzalność, precyzja
pośrednia lub odtwarzalność.
PRECYZJA
Powtarzalność to precyzja wyników uzyskanych w tych
samych warunkach pomiarowych, czyli w danym
laboratorium, przez jednego analityka, na jednym
aparacie pomiarowym, przy użyciu tych samych
odczynników i tej samej próbki oraz w krótkim czasie.
Precyzja pośrednia to precyzja wyników otrzymanych
w danym laboratorium, ale przy większej zmienności
parametrów, np. przez różnych analityków, na różnych
aparatach pomiarowych, przy użyciu różnych
odczynników (z innych partii lub innych producentów)
i różnych próbek oraz w dłuższym czasookresie.
Odtwarzalność to precyzja wyników uzyskiwanych dla
danej metody pomiarowej, ale przez różnych analityków
w różnych laboratoriach, a zatem na różnych aparatach
pomiarowych i przy użyciu różnych odczynników.
PRZYKŁAD WYZNACZANIA POWTARZALNOŚCI
OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH
METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
ZAKRES
0,1-400 MG/L
Zakres podstawowy
0,10 -1,00 mg/l
10%
zakresu
WODA
SUROWA
10%
zakresu
197/02/12-1
[mg/l]
1
2
3
4
5
6
7
xśr
Ssp
RSD
Vm
Zakres poszerzony
0,1 – 400 mg/l
50%
zakresu
WODA
UZDATNIONA
90%
zakresu
ŚCIEKI
TECHNOLOGICZNE
50%
zakresu
61/02/12-1
[mg/l]
36/03/12-1
[mg/l]
159/01/12-1
[mg/l]
215/02/12-1
[mg/l]
212/02/12-1
[mg/l]
0,109
0,115
0,108
0,110
0,105
0,110
0,102
0,108
0,0041
0,038
0,152
0,160
0,158
0,150
0,161
0,150
0,152
0,155
0,0048
0,031
0,491
0,500
0,489
0,494
0,490
0,495
0,504
0,495
0,0055
0,011
0,824
0,830
0,832
0,820
0,836
0,819
0,835
0,828
0,0070
0,008
200
206
188
190
195
193
190
195
6,43
0,033
354
355
358
346
342
344
349
350
6,08
0,017
3,80%
3,10
1,11%
0,85%
3,30%
1,74%
ŚCIEKI
ŚCIEKI
90%
zakresu
ŚCIEKI
PRZYKŁAD WYZNACZANIA PRECYZJI POŚREDNIEJ
OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH
METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
ZAKRES
0,1-400 MG/L
Wyniki dla próbki wody udział różnych analityków
w badaniach biegłości:
Analityk 1
0,188 mg/l
Analityk 2
0,195 mg/l
Analityk 3
0,183 mg/l
Analityk 4
0,180 mg/l
Analityk 5
0,198 mg/l
Średnia wartość: 0,1889 mg/l
Odchylenie standardowe średniej: 0,0077 mg/l
RSD: 4,06%
PRZYKŁAD WYZNACZANIA ODTWARZALNOŚCI
OZNACZANIE JONU AMONOWEGO W WODZIE I ŚCIEKACH METODĄ
SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
ZAKRES
0,1-400 MG/L
Wyniki dla próbki ścieków - udział różnych
laboratoriów w badaniach biegłości:
Laboratorium 1:
0,20 mg/l
Laboratorium 2:
0,23 mg/l
Laboratorium 3:
0,26 mg/l
Laboratorium 4:
0,16 mg/l
Laboratorium 5:
0,18 mg/l
Laboratorium 6:
0,21 mg/l
Średnia wartość: 0,207 mg/l
Odchylenie standardowe średniej: 0,036 mg/l
RSD: 17,2%
POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ
Dokładność to stopień zgodności pomiędzy
uzyskanym wynikiem pojedynczego pomiaru
a wartością rzeczywistą.
Poprawność (prawdziwość) to zgodność wyniku
oznaczenia (jako wartości średniej obliczonej na
podstawie serii pomiarów) z wartością rzeczywistą.
Poprawność D wyraża się zależnością:
D
x sr  μ
 100%
μ
gdzie:
μ – wartość odniesienia (certyfikowana),
xśr – wartość średnia pomiarów wielkości odniesienia.
POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ
Poprawność metody szacowana może być
w laboratorium w następujący sposób:
a) przez analizę próbki o znanym stężeniu
(np. próbki z badań międzylaboratoryjnych,
certyfikowany materiał odniesienia, laboratoryjny
materiał odniesienia) i porównanie wyników
uzyskanych daną metodą z wartością prawdziwą,
b) przez porównanie wyników badań uzyskanych
daną metodą z wynikami otrzymanymi metodą
odniesienia, której dokładność jest znana –
metoda wcześniej zwalidowana.
OCENA BADAŃ BIEGŁOŚCI
OZNACZANIE CHLORU WOLNEGO METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ
Chlor wolny
0,55
0,5
0,454
0,46
0,451
0,433
0,45
0,4
Stężenie [mg/l]
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Wartość przypisana
Wartość otrzymana ANALITYK 1
Wartość otrzymana ANALITYK 2
Wartość otrzymana ANALITYK 3
POPRAWNOŚĆ, DOKŁADNOŚĆ, PRECYZJA
μ
mała precyzja, mała poprawność, mała dokładność
μ
duża precyzja, mała poprawność, mała dokładność
μ
mała precyzja, duża poprawność, mała dokładność
μ
duża precyzja, duża poprawność, duża dokładność
PRZYKŁADY
Sytuacja I (mała precyzja, mała dokładność i mała
poprawność)
μ
mała precyzja, mała poprawność, mała dokładność
Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l
Uzyskane wyniki:
20 mg/l (dokładność: 33,3%)
25 mg/l (dokładność: 66,7%)
30 mg/l (dokładność: 100%)
40 mg/l (dokładność: 167%)
35 mg/l (dokładność: 133%)
Wartość średnia: 30 mg/l
Odchylenie standardowe: 7,91 mg/l
RSD: 26,4%
Poprawność: 100%
PRZYKŁADY
Sytuacja II (duża precyzja, mała dokładność i mała
poprawność)
μ
duża precyzja, mała poprawność, mała dokładność
Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l
Uzyskane wyniki:
31 mg/l (dokładność: 107%)
32 mg/l (dokładność: 113%)
30 mg/l (dokładność: 100%)
28 mg/l (dokładność: 86,7%)
29 mg/l (dokładność: 93,3%)
Wartość średnia: 30 mg/l
Odchylenie standardowe: 1,58 mg/l
RSD: 5,27%
Poprawność: 100%
PRZYKŁADY
Sytuacja III (mała precyzja, mała dokładność i duża
poprawność)
μ
mała precyzja, duża poprawność, mała dokładność
Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l
Uzyskane wyniki:
20 mg/l (dokładność: 33,3%)
10 mg/l (dokładność: 60%)
25 mg/l (dokładność: 66,7%)
7 mg/l (dokładność: 53,3%)
15 mg/l (dokładność: 0%)
Wartość średnia: 15,4 mg/l
Odchylenie standardowe: 7,30 mg/l
RSD: 47,4%
Poprawność: 2,67%
PRZYKŁADY
Sytuacja IV (duża precyzja, duża dokładność i duża
poprawność)
μ
duża precyzja, duża poprawność, duża dokładność
Stężenie azotu azotanowego w ściekach 15 mg/l
Uzyskane wyniki:
15,5 mg/l (dokładność: 3,33%)
15,0 mg/l (dokładność: 0%)
14,5 mg/l (dokładność: 3,33%)
15,7 mg/l (dokładność: 4,67%)
14,8 mg/l (dokładność: 1,33%)
Wartość średnia: 15,1 mg/l
Odchylenie standardowe: 0,49 mg/l
RSD: 3,28%
Poprawność: 0,67%
GRANICA WYKRYWALNOŚCI
Granica wykrywalności (LOD) danej metody
analitycznej jest to najmniejsza ilość (stężenie)
badanej substancji w próbce, która może być
wykryta za pomocą danej procedury analitycznej,
lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią
dokładnością. Jest to najmniejsze stężenie analitu,
przy którym istnieje pewność jego obecności
w próbce.
LOD  0  3  s
Granica oznaczalności danej metody analitycznej
jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej
substancji w próbce, jaka może być oznaczona
z odpowiednią precyzją i dokładnością.
LOQ  3  LOD
LOQ  2  LOD
LINIOWOŚĆ
Liniowość to zależność wprost proporcjonalną
sygnału do stężenia substancji oznaczanej w próbie
w określonym zakresie, wyznacza nam równanie
krzywej regresji:
y  bx  a
gdzie:
y – wartość mierzona
x – stężenie analitu
b – czułość (nachylenie krzywej kalibracyjnej)
a – wartość sygnału odpowiadającej próbce ślepej (dla x=0)
LINIOWOŚĆ
Współczynnik korelacji liniowej krzywej
kalibracyjnej – zależność między obu zmiennymi
charakteryzuje współczynnik korelacji liniowej
krzywej kalibracyjnej r:
n
r
_
_
 (x  x)(y  y)
i
i1
n
 (x
i1
i
_
i
 x)
n
2
_
 (y  y)
i1
2
i
gdzie:
xi – stężenie wzorca i-tego
yi – odpowiedź wzorca i-tego
Wyznaczona wartość r powinna być większa niż
0,995 w przeciwnym razie funkcja jest nieliniowa.
WZRASTAJĄCE SYGNAŁY ANALITYCZNE
OZNACZANIE PCB W WODZIE I ŚCIEKACH METODĄ GC
WZRASTAJĄCE SYGNAŁY ANALITYCZNE
OZNACZANIE OLEJU MINERALNEGO W POWIETRZU METODĄ
SPEKTOMETRII ATOMOWEJ W PODCZERWIENI (IR)
LINIOWOŚĆ
0.900
0.800
y = 0.7253x + 0.0043
R² = 0.9939
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
ZAKRES POMIAROWY
Zakres pomiarowy jest to przedział między
minimalną i maksymalną zawartością
(np. stężeniem) substancji w badanej próbce,
w którym metoda analityczna ma odpowiednią
liniowość, dokładność i precyzję.
Zakres pomiarowy określa się na podstawie wyników
uzyskanych w części: liniowość, dokładność
i precyzja. Określa się go przez porównanie
zakresów, w których spełnione są kryteria
akceptacji dla powyższych badań.
SELEKTYWNOŚĆ
Selektywność to możliwość dokładnego i precyzyjnego
oznaczenia badanej substancji w obecności innych
składników w próbce rzeczywistej w danych
warunkach pomiarowych.
Selektywność metody badana jest poprzez pomiary
zawartości danego analitu z dodatkiem wzorca i bez
jego dodatku i wyznaczenie odzysku.
x
x
1
2
R

x
100
%
3
gdzie:
x1- średnia wartość próbki z dodatkiem określonej ilości wzorca,
x2- średnia wartość próbki nie wzmocnionej,
x3- dodana ilość wzorca.
PRZYKŁAD
Oznaczanie fosforu ogólnego w ściekach metodą
atomowej spektrometrii emisyjnej ze wzbudzeniem
w palmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES)
Pomiar 1
Pomiar 2
Pomiar 3
Pomiar 4
Pomiar 5
Pomiar 6
Pomiar 7
Średnia
RSD
Odzysk
88/06/12-5
1,89
1,92
1,95
1,99
2,08
2,12
2,15
2,01
5,1%
88/06/12-5
+10mg/l
10,25
11,23
11,56
12,87
13,25
13,4
13,5
12,3
10,4%
88/06/12-5
+50mg/l
117
118
124
126
132
134
138
127
6,31%
88/06/12-5
+500mg/l
930
940
947
956
958
962
965
951
1,34%
102,8%
109,9%
100,8%
ODPORNOŚĆ
Odporność (niewrażliwość) metody określa wpływ
niewielkich wahań warunków, w których prowadzi
się pomiary, na wartość wyniku końcowego
oznaczenia. Jest to parametr odnoszący się do
zmian warunków wewnątrz laboratorium. Jeśli
pomiar jest wrażliwy na zmianę warunków
analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio
kontrolowane i utrzymywane w miarę możliwości na
stałym poziomie.
ELASTYCZNOŚĆ
Elastyczność (tolerancyjność) to parametr określający
przydatność danej metody analitycznej w przypadku różnych
warunków.
Przykłady typowych zmian to:
• stabilność badanych roztworów (np. po 24 godzinach),
• wpływ wahań temperatury,
• wpływ wahań ciśnienia,
• wpływ zmian czystości i rodzaju stosowanych odczynników,
• wpływ wahań pH,
• wpływ temperatury i czasu mineralizacji próbki,
• wpływ czasu poboru pyłu z powietrza,
• stabilność wagi prób pyłów (np. po 24 i 48 godzinach) itp.
Wartość tych parametrów obliczana jest na podstawie badania
zmian wartości odchylenia standardowego serii pomiarów
przy niewielkich zmianach parametrów stosowanej metody
analitycznej.
DZIĘKUJĘ
ZA
UWAGĘ