Temat: Żywność jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza

Temat: Żywność jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Mikrobiologia ogólna
o
Biotechnologia medyczna II rok / I
Temat: Żywność jako środowisko życia mikroorganizmów. Analiza mikrobiologiczna – Cz.1/Cz.2/Cz.3
CZEŚĆ TEORETYCZNA
1. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne surowców.
2. Techniki pobierania próbek żywności do badań mikrobiologicznych, ich transport i przechowywanie.
CZEŚĆ PRAKTYCZNA
I.
OZNACZANIE LICZBY MIKROORGANIZMÓW METODĄ PŁYTKOWĄ W
TEMPERATURZE 30oC wg PN-EN ISO 4833: 2004
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby mikroorganizmów w większości produktów żywnościowych i paszach
oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności.
Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć
płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny
wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
Przenieść do sterylnych płytek Petriego po 1 ml próbki płynnej lub zawiesiny wyjściowej w przypadku produktów stałych.
Następnie wlać po ok. 15 ml pożywki (Agar M), schłodzonej do temp. 44-47oC i delikatnie wymieszać materiał z pożywką . Na każde
przygotowane rozcieńczenie użyć co najmniej po dwie płytki.
Uwaga! W przypadku przewidywania, że produkt zawiera drobnoustroje tworzące na powierzchni pożywki rozlane kolonie, zalać posiana
pożywkę 4 ml agaru wodnego i pozostawić do zestalenia.
Inkubacja:
płytki odwrócone denkiem do góry
30 ± 1oC / 72 ± 3h
Odczyt – policzyć wszystkie kolonie, a w przypadku uzyskania wzrostu
zlewnego traktować go jako pojedyncze kolonie
Podawanie wyników
Wynik końcowy podać jako liczbę mikroorganizmów w 1 ml lub 1 g badanej próbki zgodnie z normą PN-EN ISO 4833:
2004.
II. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP
FEKALNY METODĄ PŁYTKOWĄ W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH wg PN-ISO
4832: 2007
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby bakterii z grupy coli w większości produktów spożywczych i paszach
oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności.
Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć
płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny
wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
Przenieść po 1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego i zalać 15 ml
podłoża VRBL. Po zestaleniu wlać po ok. 4 ml pożywki VRBL
Inkubacja:
30, 37 oC (bakterie z grupy coli) lub 44oC (bakterie z grupy coli typ fekalny) / 24 ± 2 h
Odczyt – policzyć wszystkie kolonie barwy ciemnopurpurowej na każdej płytce zawierającej mniej niż 150 charakterystycznych
kolonii. W przypadku wystąpienia kolonii nietypowych należy dokonać potwierdzenia. W tym celu należy wybrać po pięć
kolonii i posiać na pożywkę z laktozą, żółcią i zielenią brylantową
Inkubacja:
37 oC (bakterie z grupy coli i bakterie z grupy coli typ fekalny) / 24 ± 2 h
Podawanie wyników
Wynik końcowy podać jako liczba bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g badanej próbki, zgodnie z normą PN-ISO 4832:
2007.
III. OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI I BAKTERII Z GRUPY COLI TYP
FEKALNY W ŻYWNOŚCI I INNYCH PRODUKTACH METODĄ NAJBARDZIEJ
PRAWDOPODOBNEJ LICZBY wg PN-ISO 4831: 2007
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby bakterii z grupy coli w większości produktów spożywczych i paszach
oraz innych matrycach pod warunkiem wykazania jej przydatności.
Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
W zależności od systemu posiewu: 3x1g (ml), 3x0,1g (ml), 3x0,01g (ml) itd. lub 5x1g (ml), 5x0,1g (ml), 5x0,01g (ml) itd.
przenieść po 10 ml zawiesiny wyjściowej do 2xstęzonej pożywki namnażająco-selektywnej. W przypadku posiewu 1 ml
zawiesiny wyjściowej i kolejnych jej rozcieńczeń zastosować należy pożywkę 1xstężoną.
Inkubacja:
30 lub 37 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h)
Po inkubacji z każdej dodatniej probówki (zmętnienie/gaz) pobrać hodowlę i przenieść do probówek z pożywką potwierdzająca
Inkubacja: 30 lub 37 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h)
Odczyt – za dodatni wynik należy uznać obecność zmętnienia lub gazu (obecność bakterii z grupy coli)
W celu potwierdzenia obecności bakterii z grupy coli typ fekalny należy przenieść hodowlę z każdej dodatniej probówki z pożywką
potwierdzającą grupę coli na agar Endo
Inkubacja: 44 ± 1oC / 24 ± 2 h (48 ± 2 h)
Odczyt – za dodatni wynik należy uznać obecność ciemnoczerwonych kolonii często z metalicznym zielonozłotym połyskiem
(obecność bakterii z grupy coli typ fekalny)
Podawanie wyników
Wynik końcowy podać jako NPL bakterii z grupy coli w 1 ml lub 1 g badanej próbki na podstawie tablic NPL, zgodnie
z normą PN-ISO 4831: 2007.
IV. WYKRYWANIE I OZNACZANIE LICZBY ENTEROBACTERIACEAE
wg PN-ISO 21528-2: 2005
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby Enterobacteriaceae w większości produktów spożywczych i paszach
oraz próbkach środowiskowych z obszaru produkcji i obrotu żywnością.
4. Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć
płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny
wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
Przenieść po 1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego i
zalać 10 ml podłoża VRBG. Po zestaleniu wlać po 15 ml pożywki
VRBG
Inkubacja:
37oC / 24 ± 2 h
Odczyt – policzyć wszystkie kolonie barwy różowej do purpurowej na każdej płytce zawierającej
mniej niż 150 charakterystycznych kolonii
Wykonać testy potwierdzające dla Enterobacteriaceae
1. Test na obecność oksydazy
2. Test na zdolność fermentacji
5. Podawanie wyników
Kolonie, które są oksydazo-ujemne i glukozo-dodatnie uważa się za potwierdzone jako Enterobacteriaceae. Wynik
końcowy podać jako liczba Enterobacteriaceae w 1 ml lub 1 g badanej próbki.
V. OZNACZANIE LICZBY GRONKOWCÓW KOAGULAZO-DODATNICH W ŻYWNOŚCI
METODĄ Z ZASTOSOWANIEM POŻYWKI AGAROWEJ BAIRD-PARKERA
wg PN-EN ISO 6888-1: 2001+ PN-EN ISO 6888-1: 2001/A1: 2004
Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO 6888-1: 2001+ PN-EN ISO 6888-1: 2001/A1: 2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich
(Staphyloccocus aureus i innych gatunków). Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera.
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich w większości produktach
spożywczych i paszach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta.
Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową próbki, a jako rozcieńczalnika użyć
płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny
wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
Przenieść po 0,1 ml z każdego rozcieńczenia do dwóch płytek Petriego z
podłożem Baird-Parkera i rozprowadzić inokulum na całej powierzchni
podłoża
Inkubacja:
35 lub 37oC±1oC / 24±2 h (+ dodatkowe 24±2 h)
Odczyt:
- Po 24 h: zaznaczyć na dnie płytki każdą typową kolonię.
- Po 48 h: zaznaczyć wszystkie nowe typowe kolonie i kolonie nietypowe.
Kolonie typowe: czarne lub szare, błyszczące i wypukłe (od 1 mm do 1,5 mm średnicy po inkubacji trwającej 24 h, i od 1,5 mm do 2,5 mm
średnicy po inkubacji 48 h), otoczone przezroczysta strefą, która może być częściowo nieprzezroczysta. Po inkubacji co najmniej 24 h, w
opalizującym pierścieniu, w kontakcie z koloniami może ukazywać się przezroczysta obwódka.
Kolonie nietypowe: wykazują tę sama wielkość co typowe kolonie i mogą charakteryzować się następującymi cechami: czarne błyszczące
kolonie z wąskim białym brzegiem lub bez niego; nieobecna lub słabo widoczna przezroczysta obwódka oraz nieobecny lub słabo widoczny
opalizujący pierścień; lub są szare bez przezroczystej obwódki.
Uwaga!: Wszystkie inne kolonie obecne na płytkach, które nie wykazują typowego lub nietypowego wyglądu należy uznać za mikroflorę
towarzyszącą
Potwierdzenie:
Do potwierdzenia wybrać co najmniej po 5 typowych i nietypowych kolonii. Z każdej kolonii
pobrać materiał i przenieść do probówki z bulionem mózgowo-sercowym.
Inkubacja:
35 lub 37oC±1oC / 24±2 h
Test na koagulazę:
Do probówek zawierających po 0,3 ml uwodnionej plazmy króliczej dodać po 0,1 ml hodowli na
bulionie mózgowo-sercowym.
Inkubacja:
35 lub 37oC±1oC
Odczyt:
Dokonać odczytu po 4 do 6 h inkubacji. Za wynik pozytywny należy uznać, jeżeli objętość skrzepu wynosi więcej niż
połowę początkowej objętości płynu.
Uwaga!:
Dla każdej partii plazmy należy wykonać negatywną próbę kontrolną, dodając 0,1 ml jałowego bulionu mózgowosercowego do zalecanej objętości plazmy i inkubować. Aby zapewnić prawidłowe wykonanie testu na koagulazę,
stosowana plazma nie może wykazywać żadnych śladów skrzepów.
Podawanie wyników
Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO 6888-1: 2001+ PN-EN ISO 6888-1: 2001/A1: 2004 jako liczbę
gronkowców koagulazo-dodatnich w 1 ml lub 1 g badanej próbki.
VI. OZNACZANIE LICZBY GRONKOWCÓW KOAGULAZO-DODATNICH W ŻYWNOŚCI
METODĄ NPL wg PN-EN ISO 6888-3: 2004+ PN-EN ISO 6888-3: 2004/AC: 2005
Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO 6888-3: 2004+ PN-EN ISO 6888-3: 2004/AC: 2005Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich
(Staphyloccocus aureus i innych gatunków). Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie liczby metodą NPL.
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich w większości produktach
spożywczych i paszach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i zwierzęta oraz próbkach środowiskowych
związanych z produkcją żywności.
Przebieg procedury
Przygotować zawiesinę wyjściową, a jako rozcieńczalnika użyć
płynu do rozcieńczeń
Przygotować kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny
wyjściowej przy użyciu płynu do rozcieńczeń
Zastosować system posiewu: 3x1g (ml), 3x0,1g (ml), 3x0,01g (ml). W tym celu przenieść po 10 ml zawiesiny wyjściowej do 2 x stężonej
pożywki Giolitti-Cantoni. W przypadku posiewu 1 ml zawiesiny wyjściowej i kolejnych jej rozcieńczeń zastosować należy pożywkę
1xstężoną. Dokładnie wymieszać pożywkę z posianym materiałem i wprowadzić ostrożnie schłodzony agar, tak aby powstał
uszczelniający korek i pozostawić do zestalenia.
Inkubacja: 37oC±1oC / 24±2 h
Odczyt: Reakcja dodatnia: zaczernienie pożywki lub czarny osad. Z dodatnich probówek przenieść materiał na płytki Petriego z pożywką
agarową Baird-Parkera W przypadku braku pozytywnych reakcji przedłużyć inkubację o dodatkowe 24±2 h i przesiać z pozostałych
probówek w których stwierdzono lub nie stwierdzono reakcji pozytywnej
Inkubacja: 37oC±1oC / 24±2 h
Odczyt:- Po 24 h: zaznaczyć na dnie płytki każdą typową kolonię. - Po 48 h: zaznaczyć wszystkie nowe typowe kolonie i kolonie nietypowe.
Kolonie typowe: czarne lub szare, błyszczące i wypukłe (od 1 mm do 1,5 mm średnicy po inkubacji trwającej 24 h, i od 1,5 mm do 2,5 mm
średnicy po inkubacji 48 h), otoczone przezroczysta strefą, która może być częściowo nieprzezroczysta. Po inkubacji co najmniej 24 h, w
opalizującym pierścieniu, w kontakcie z koloniami może ukazywać się przezroczysta obwódka.
Kolonie nietypowe: wykazują tę sama wielkość co typowe kolonie i mogą charakteryzować się następującymi cechami: czarne błyszczące
kolonie z wąskim białym brzegiem lub bez niego; nieobecna lub słabo widoczna przezroczysta obwódka oraz nieobecny lub słabo widoczny
opalizujący pierścień; lub są szare bez przezroczystej obwódki.
Uwaga!: Wszystkie inne kolonie obecne na płytkach, które nie wykazują typowego lub nietypowego wyglądu należy uznać za mikroflorę
towarzyszącą
Potwierdzenie:
Do potwierdzenia wybrać co najmniej po 5 typowych i nietypowych kolonii. Z każdej kolonii
pobrać materiał i przenieść do probówki z bulionem mózgowo-sercowym.
Inkubacja:
35 lub 37oC±1oC / 24±2 h
Test na koagulazę:
Do probówek zawierających po 0,3 ml uwodnionej plazmy króliczej dodać po 0,1 ml hodowli na
bulionie mózgowo-sercowym.
Inkubacja:
35 lub 37oC±1oC
Odczyt:
Dokonać odczytu po 4 do 6 h inkubacji. Za wynik pozytywny należy uznać, jeżeli objętość skrzepu wynosi więcej niż
połowę początkowej objętości płynu.
Uwaga!:
Dla każdej partii plazmy należy wykonać negatywną próbę kontrolną, dodając 0,1 ml jałowego bulionu mózgowosercowego do zalecanej objętości plazmy i inkubować. Aby zapewnić prawidłowe wykonanie testu na koagulazę,
stosowana plazma nie może wykazywać żadnych śladów skrzepów.
Podawanie wyników
Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO 6888-3: 2004 + PN-EN ISO 6888-3: 2004/AC: 2005 jako NPL
gronkowców koagulazo-dodatnich w 1 ml lub 1 g badanej próbki.
VII. WYKRYWANIE PAŁECZEK SALMONELLA spp. wg. PN-EN ISO 6579: 2003
Instrukcja wykonana na podstawie normy PN-EN ISO 6579: 2003 – Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella
spp.
Zakres stosowania metody
Metoda ma zastosowanie do wykrywania obecności pałeczek Salmonella spp. w żywności i paszach przeznaczonych do
spożycia przez ludzi i zwierzęta, a także w próbkach środowiskowych związanych z produkcją i przetwórstwem
żywności oraz próbkach naturalnych (osady, gleby, wszystkie rodzaje wód).
Przebieg procedury
Przednamnażanie
Odważyć 25 g badanej próbki i przenieść do 225 ml zbuforowanej wody peptonowej (lub jej
wielokrotność przy zachowaniu stosunku 1:9). W przypadku próbek wody należy przefiltrować 100 ml
badanej próbki przez filtr membranowy o rozmiarach porów 45 µm, a następnie filtr umieścić w 225 ml
zbuforowanej wody peptonowej. Podobnie postępować z wymazami z powierzchni i tusz zwierzą rzeźnych.
Inkubacja:
37oC±1oC / 18±2 h
Selektywne namnażanie
Po inkubacji przenieś 0,1 i 1 ml zawiesiny, odpowiednio, do pożywki RVS i MKTTn
Inkubacja:
Pożywka RVS: 41,5oC±1oC / 24±3 h
Pożywka MKTTn: 37oC±1oC / 24±3 h
Posiew na selektywne podłoża agarowe
Po inkubacji przy pomocy ezy przenieś hodowlę z każdej pożywki płynnej na podłoże BGA i
podłoże XLD i dokonać posiewu redukcyjnego, tak aby uzyskać pojedyncze kolonie
Inkubacja:
37oC±1oC / 24±3 h
Odczyt:
Kolonie na BGA: typowe kolonie są różowe, wypukłe i drobne otoczone strefą czerwono zabarwionej pożywki.
Kolonie na XLD: typowe kolonie mają czarny zabarwiony środek oraz lekko przezroczyste obrzeże czerwonawej barwy
spowodowane zmianą zabarwienia wskaźnika
Uwaga!: Szczepy Salmonella nie produkujące siarkowodoru rosną na XLD w postaci różowych kolonii z ciemniejszymi
środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną w postaci żółtych kolonii z charakterystycznym zaczernieniem lub bez
takiego czarnienia.
Dokonać posiewu charakterystycznych i podejrzanych kolonii na agar odżywczy (co najmniej jedną z
każdej płytki (w przypadku wyniku negatywnego do potwierdzenia wybrać dalsze cztery kolonie)
Inkubacja:
37oC±1oC / 24±3 h
Potwierdzenie
Potwierdzenie serologiczne: wykonać aglutynację szkiełkową z wykorzystaniem surowic O, Vi, H, przy czym w
pierwszej kolejności należy sprawdzić możliwość wystąpienia autoaglutynacji (w przypadku pozytywnej reakcji
nie należy wykonywać testu z pozostałymi surowicami)
Potwierdzenie biochemiczne: użyć gotowych testów API 20E i postępować zgodnie z zaleceniami producenta, a odczytu
dokonać przy pomocy specjalnej ksiązki kodowej.
Podawanie wyników
Wynik podać zgodnie z Normą PN-EN ISO 6579: 2003 jako obecność lub nieobecność Salmonella spp. w 25 g (ml)
próbki lub jako obecność lub nieobecność w 100 ml wody i na określonej powierzchni wymazu.