Wyróżniona praca w formacie pdf

X LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE W GDYNII
IM. GDYŃSKICH NAUCZYCIELI BOHATERÓW II WOJNY ŚWIATOWEJ
ZASTOSOWANIE ELICYTORÓW BIOTYCZNYCH POCHODZENIA
BAKTERYJNEGO W ROŚLINNYCH KULTURACH IN VITRO
DIONAEA MUSCIPULA I DROSERA CUNEIFOLIA W CELU
POZYSKANIA SUBSTANCJI BIOLOGICZNIE CZYNNYCH
Aleksandra Siluta
Klasa IIe
Opiekun: mgr Ewa Faka
PODZIĘKOWANIA
Realizacja pracy była łatwiejsza, dzięki wsparciu, inspiracji i cennym
uwagom prof. dr hab. inż. Aleksandry Królickiej. Jestem jej bardzo
wdzięczna za umożliwienie prowadzenie badań w Katedrze Biotechnologii
Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego.
Gdynia, 2015
STRESZCZENIE
Rośliny owadożerne są źródłem związków biologicznie czynnych
(metabolitów wtórnych) z grupy naftochinonów i flawonoidów. Poziom tych
związków może być zwiększony dzięki zastosowaniu elicytorów (wyzwalaczy) w
roślinnych kulturach in vitro. Badania prowadzono z wykorzystaniem kultur in
vitro 2 gatunków roślin owadożernych: Drosera cuneifolia i Dionaea muscipula.
Hodowle prowadzono na pożywce płynnej Murashige i Skoog (½ MS) i pożywce
½ MS bez dodatku soli azotowych. W pożywce zastosowano również elicytor w
postaci autoklawowanego lizatu bakterii Enterobacter sakazaki.
Badania dowiodły, iż zastosowany elicytor nie wykazał istotnego wpływu
na poziom naftochinonów w tkankach roślin owadożernych, które oznaczono
przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wykazano również,
iż
ekstrakty
z
roślin
owadożernych
miały
silne
właściwości
przeciwdrobnoustrojowe w stosunku do bakterii G (+)– Staphylococcus aureus
i grzyba – Candida albicans. Najwyższą oporność na ekstrakty wykazywał
Pseudomonas aeruginosa – G (-) bakteryjny patogen człowieka. Różna wrażliwość
patogenów na metabolity wtórne z roślin owadożernych jest zależna od budowy
ściany komórkowej oraz zawartości związków biologicznie czynnych –
naftochinonów i najprawdopodobniej flawonoidów.
WSTĘP
Rośliny wytwarzają metabolity wtórne, czyli związki chemiczne aktywne
biologicznie, które nie są niezbędne dla funkcjonowania i przeprowadzania
podstawowych procesów życiowych rośliny, ale pełnią znaczącą rolę
w przystosowaniu do warunków otaczającego środowiska. Metabolity wtórne
są wykorzystywane przez człowieka do produkcji leków, kosmetyków,
barwników, dodatków do żywności (przyprawy, aromaty, używki)
oraz biopestycydów. W roślinach pełnią one funkcje obronne, allelopatyczne oraz
jako atraktanty dla owadów i innych zwierząt. Elicytory odgrywają znaczącą rolę
w produkcji wtórnych metabolitów. Działają one na zasadzie czynników
„stresowych”, zmieniają metabolizm i wywołują reakcje obronne w roślinach, co
prowadzi do gromadzenia się metabolitów wtórnych. W roślinnych kulturach in
vitro stosuje się elicytory w celu podwyższenia poziomu metabolitów wtórnych
w tkankach roślinnych.
Pierwszym celem badań było sprawdzenie jaki wpływ ma elicytor - lizat
bakteryjny Enterobacter sakazaki na produkcję naftochinonów (plumbaginy
i ramentaceonu) w tkankach roślin owadożernych z gatunku Dionaea muscipula i
Drosera cuneifolia w roślinnych kulturach in vitro. Drugim celem projektu było
zbadanie czy zastosowana elicytacja zwiększy skuteczność bakterioi grzybobójczą ekstraktów uzyskanych z roślin w stosunku do groźnych
patogenów bakteryjnych człowieka z gatunku S. aureus i P. aeruginosa
oraz grzybowych – C. albicans.
MATERIAŁY I METODY
1. Hodowla roślin owadożernych in vitro i elicytacja metabolitów wtórnych.
Materiał roślinny w postaci kultur in vitro 2 gatunków roślin
owadożernych Dionaea muscipula i Drosera cuneifolia pochodził z hodowli
Katedry Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu
Medycznego. Ekperymenty prowadzono w 25 ml kolbach Erlenmajera.
Testowano 4 warianty pożywek do hodowli roślin: A) pożywka ½MS
(pożywka Murashige i Skoog z obniżoną o połowę ilością makroelementów,
[12]); B) pożywka ½MS + 1% lizat z bakterii Enterobacter sakazaki; C) pożywka
½ MS bez soli azotowych; D) pożywka ½MS bez soli azotowych + 1% lizat z
bakterii E. sakazaki. Wszystkie pożywki zawierały 2% sacharozy, pH = 5,5.
Lizat bakteryjny z E. sakazaki uzyskano z nocnej hodowli bakterii hodowanych
na pożywce płynnej Luria Bretani. Do jałowych pożywek (A, B, C, D)
wykładano jałowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza po kilka
roślin z każdego gatunku. Hodowle prowadzono przez 30 dni na
wytrząsarkach w fitotronach w temp. 20oC przy natężeniu światła 900 luxów
(fotoperiod 16/8). Wszystkie warianty były prowadzone w 3 niezależnych
powtórzeniach.
2. Ekstrakcja metabolitów z tkanek roślinnych i analiza chromatograficzna.
Po 30 dniach hodowli ważono po 2 g mokrej masy (mm) roślinnej zebranej
z pożywek A, B, C i D, dodawano po 10 ml tetrahydrofuranu, 10 ml wody i 2
g NaCl. Po wymieszaniu próbówki wirowano z prędkością 8000 rcf (relative
centrifugal force) w celu uzyskania fazy organicznej i nieorganicznej. Fazę
organiczną filtrowano przez filtr strzykawkowy (teflonowa membrana, 0,2
µm). Po 4 ml ekstraktów odparowywano i zawieszano w 2 ml metanolu. Tak
przygotowane
ekstrakty
były
analizowane
z
wykorzystaniem
wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Zawartość rametaceonu
w tkankach D. cuneifolia i plumbaginy w tkankach D. muscipula oznaczano
wykorzystując MeOH : H2O (program gradientowy od 30 do 90% MeOH).
3. Badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów.
Do 96-dołkowych jałowych płytek nakładano ekstrakty metanolowe
z roślin owadożernych w objętościach od 50 do 2 µl, a po ich odparowaniu
do sucha dodawano 100 µl pożywki BHI. Do tak przygotowanych studzienek
dodawano 10 µl zawiesiny bakterii z gatunku P. aeruginosa, S. aureus (5 x 107) i
grzyba z gatunku C. albicans (5 x 107). Następnie płytki inkubowano przez 24h
w 37oC. Brak zmętnienia pożywki w dołku wskazywał na minimalne stężenie
hamujące wzrost mikroorganizmów. Zawartość dołków w których nie
obserwowano zmętnienia wysiewano następnie na murawę na pożywkę Luria
Agar i inkubowano przez 24 h w 37oC. Brak wzrostu mikroorganizmów
wskazywał na minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC) lub grzybobójcze
(MFC).
WYNIKI
Rośliny owadożerne z gatunku D. cuneifolia i D. muscipula hodowano
w kulturach in vitro na dwóch kombinacjach pożywek roślinnych: ½MS
(kombinacja A) oraz ½MS bez soli azotowych (kombinacja C). Wzrost roślin
na obu pożywkach był zbliżony i wynosił (D. cuneifolia - 25g mokrej masy
(mm)/Erlenmajerka i D. muscipula 10g mm/Erlenmajerka) i nie różnił
się od siebie statystycznie. Zaobserwowano jedynie niewielką różnicę w poziomie
plumbaginy w tkankach D. muscipula. O ile na pożywce ½MS wykazano obecność
1325 µg plumbaginy w 1 g mm tkanki, o tyle na pożywce ½MS bez soli azotowych
wartość ta wynosiła 1180 µg plumbaginy/1g mm (Fig. 1). W przypadku tkanek D.
cuneifolia na pożywce ½MS oznaczono 800 µg ramentaceonu/1g mm, a na
pożywce bez soli azotowych o 100 µg mniej ramentaceonu/1g mm (Fig. 1).
Dodanie elicytora w postaci lizatu z E. sakazaki do pożywek spowodowało
zmniejszenie poziomu ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia o około 100 µg/1g
mm w porównaniu do kontroli w przypadku pożywki ½ MS (Fig. 1). W
pozostałych przypadkach nie odnotowano statystycznie istotnych różnic (Fig. 1).
Figura 1. Porównanie poziomu naftochinonów (plumbaginy w tkankach
D. muscipula i ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia).
Kolejnym etapem badań było sprawdzenie aktywności bakterioi grzybobójczych ekstraktów uzyskanych z roślin owadożernych. Do badań
wykorzystano 2 bakteryjne patogeny ludzkie oporne na szereg antybiotyków:
Pseudomonas aeruginosa - gram-ujemną bakterię oportunistyczną powodującą
zakażenia wewnątrzszpitalne i Staphylococcus aureus - bakterię gram-dodatnią,
często powodującą zakażenia w szpitalach, wytwarzającą enterotoksynę odporną
na wysokie temperatury oraz pasożytniczy grzyb: Candida albicans – z rodziny
drożdżaków, powodujący szereg schorzeń miejscowych i systemowych,
szczególnie groźnych dla pacjentów z rozległymi ranami oparzeniowymi.
Badania wykazały, że najwrażliwszy na ekstrakty z roślin owadożernych był C.
albicans. W tym przypadku zastosowanie od 10 do 20 mg mm/ml ekstraktów
wykazywało efekt grzybobójczy (Tab. 1). Z kolei w przypadku bakterii najsilniej
działał ekstrakt z tkanek D. muscipula na S. aureus, gdzie MBC wynosiło 20 mg
mm/ml. Wyższe wyniki uzyskany dla tkanek D. muscipula rosnących na pożywce
½ MS z elicytorem są spowodowane najprawdopodobniej błędnym odważeniem
mokrej masy i nie były brane pod uwagę w analizie (Tab. 1). Najbardziej oporny
na działanie ekstraktów był P. aeruginosa. Aby skutecznie wyeliminować tego G
(-) patogena trzeba zastosować od 200 do 500 mg mm/1ml (Tab. 1).
Tabela 1. Porównanie aktywności bakterio- i grzybobójczej ekstraktów z tkanek Drosera
cuneifolia i Dionaea muscipula (MBC – minimalne stężenie bakteriobójcze; MFC – minimalne
stężenie grzybobójcze).
Pseudomonas aeruginosa
G (-)
Gatunek
rośliny i
rodzaj
pożywki
hodowlanej
MBC mg
mm/ml
Ekwiwalent
naftochinonów
µg/ml
Staphylococcus aureus
G (+)
MBC mg
mm/ml
Ekwiwalent
naftochinonów
µg/ml
Candida albicans
MFC mg
mm/ml
Ekwiwalent
naftochinonów
µg/ml
Drosera cuneifolia
½ MS
½ MS +
E. sakazaki
½ MS bez
azotu
½ MS bez
azotu +
E. sakazaki
400
320
35
28
15
12
300
217,5
20
14,5
10
7,2
400
280
35
24,5
15
10,5
400
286
20
14,3
15
10,7
Dionaea muscipula
½ MS
½ MS +
E. sakazaki
½ MS bez
azotu
½ MS bez
azotu +
E. sakazaki
200
265
20
26,5
15
19,9
500
670
50
67
20
26,8
300
354
20
23,6
15
17,7
200
243
20
24,3
15
18,2
Na uwagę zasługuje fakt, iż aktywność bakterio- i grzybobójcza ekstraktów nie
była bezpośrednio skorelowana z obecnością naftochinonów w tkankach roślin
owadożernych (Fig. 1, Tab. 1). Świadczy to o tym, iż na aktywność biologicznie
czynną ekstraktów składa się działanie zarówno naftochinonów, jak również
innych metabolitów zawartych w tkankach roślin owadożernych (flawonoidów),
które nie były przedmiotem badań w niniejszym projekcie.
DYSKUSJA
Głównymi metabolitami wtórnymi wytwarzanymi przez rośliny owadożerne
są związki z grupy naftochinonów i flawonoidów [9, 11]. W ramach niniejszego
projektu badano wpływ 2 naftochinonów: plumbaginy w tkankach D. muscipula
i ramentaceonu w tkankach D. cuneifolia w kulturach roślinnych in vitro na groźne
patogeny człowieka. W celu podwyższenia poziomu metabolitów wtórnych w
kulturach in vitro roślin owadożernych zastosowano elicytor w postaci lizatu
bakteryjnego E. sakazaki. Dodanie elicytora do pożywki na której rosły rośliny
owadożerne skutkowało niewielkim spadkiem poziomu ramentaceonu i nie
wpłynęło znacząco na poziom plumbaginy w tkankach roślinnych. Odmienne
wyniki elicytacji odnotował zespół Putalun [6], wykazując 3-krotny wzrost
poziomu plumbaginy w tkankach Drosera burmanii pod wpływem działania
elicytora - jasmonianu metylu. Podobne wyniki uzyskał Ziaratnia i in. [7]
zwiększając poziom naftochinonów w Drosera capensis poprzez poddanie do
pożywki kwasu jasmonowego i kwasu salicylowego. Literatura naukowa
wskazuje, że zastosowanie różnych elicytorów w różnych gatunkach roślin
owadożernych może wywoływać różny wpływ na poziom naftochinonów.
Jakkolwiek w trakcie wykonywania niniejszego projektu nie zaobserwowano
podwyższenia poziomu naftochinonów w tkankach roślin owadożernych
w wyniku elicytacji, to ekstrakty uzyskane z tych roślin wykazały wyższą
aktywność przeciwdrobnoustrojową w porównaniu do roślin nie poddanych
elicytacji. Wydaje się wielce prawdopodobne, że elicytacja spowodowała
podwyższenie poziomu innych wtórnych metabolitów zawartych w roślinach
owadożernych, a mianowicie flawonoidów, które nie były badane w ramach
tego projektu. Podwyższenie poziomu flawonoidów pod wpływem działania
elicytorów w tkankach roślin owadożernych odnotowała między innymi Królicka
i in. [2].
Działanie przeciwdrobnoustrojowe naftochinonów zostało wykazane
przez szereg zespołów naukowych [1,2,4,10]. Te cenne metabolity wtórne
są z powodzeniem wykorzystywane przez człowieka w przemyśle
farmaceutycznym. Ekstrakty z roślin owadożernych zawierających plumbaginę
wykazują aktywność grzybobójczą w stosunku do C. albicans [10]. Zastosowanie
10-20 mg mm/ml ekstraktu skutecznie eliminuje tego groźnego dla człowieka
grzyba. Ekstrakty roślinne pozyskane z tkanek D. muscipula wykazały dużą
skutecznością przeciwdrobnoustrojową w stosunku do S. aureus, gdzie MBC
wynosiło 20 mg mm/ml. Podobne wyniki odnotował Didry [1], opisując działanie
metabolitów wtórnych na bakterie G (+) jamy ustnej. Machado wraz z zespołem
[8] badali wpływ naftochinonów w ekstraktach roślinnych pozyskanych z Punica
granatum i Tabebuia avellanedae na S. aureus, a Khan i Timi [5] ekstraktów
uzyskanych z Diospyros lolin, D. maritima i D. novoguinensis. W obu przypadkach
stwierdzono aktywność przeciwbakteryjną naftochinonów względem S. aureus.
W ramach przedstawionego projektu wykazano, że ekstrakty z roślin
owadożernych wykazały wysoką aktywność przeciw bakterii G (+) S. aureus
i silne działanie hamujące wzrost C. albicans, jednakże wobec P. aeruginosa G (-)
bakterii, okazały się mało skuteczne. Zespół De Paiva prowadził badania
na innych G (-) bakteriach jak Salmonella typhimurium i Escherichia coli
i ich badania wykazały małą aktywność plumbaginy w stosunku do tych bakterii.
Królicka i in. [3] również wykazali wysoką oporność P. aeruginosa na działanie
ekstraktów chloroformowych zawierających naftochinony z roślin
owadożernych. Taka różnica w aktywności naftochinonów przeciwko patogenom
prawdopodobnie jest spowodowana różnicą w budowie ściany komórkowej.
Bakterie G (+) posiadają grubą ścianę mureinową, natomiast bakterie G (-) mają
cienką ścianę komórkową z dwiema błonami komórkowymi. Wśród bakterii G () skuteczność wykazują tylko ekstrakty metanolowe z roślin owadożernych
zawierające flawonoidy [2]. W ramach niniejszego projektu do ekstrakcji
metabolitów wtórnych zawartych w D. cuneifolia i D. muscipula zastosowano THF.
Zastosowanie tego rozpuszczalnika spowodowało, że ekstrakty zawierały
mieszaninę naftochinonów i flawonoidów. Dzięki zawartości 2 różnych grup
związków możliwe było zaobserwowanie efektu synergii. Zjawisko to może być
efektem współpracy wtórnych metabolitów roślinnych i odpowiednich związków
działających przeciwdrobnoustrojowo powodując wzrost aktywności preparatu
przeciwko drobnoustrojom mimo braku wzrostu poziomu naftochinonów w
tkankach roślin owadożernych, co stwierdziła Krychowiak i in. [4].
PIŚMIENNICTWO
1) Didry N, Dubreuil L, Trotin F, Pinkas M (1998). Antimicrobial activity of aerial parts of Drosera petalta Smith
on oral bacteria. J. Ethnopharmacol. 60:91–96
2) Królicka A, Szpitter A, Gilgenast E i in. (2008). Stimulation of antibacterial naphthoquinones and flavonoids
accumulation in carnivorous plants grown in vitro by addition of elicitors. Enzyme Microbial Technol. 42:216-221.
3) Królicka A, Szpitter A, Maciag M i in. (2009). Antibacterial and antioxidant activity of the secondary metabolites
from in vitro cultures of the Alice sundew (Drosera aliciae). Biotechnol. Appl. Biochem. 53:175- 184.
4) Krychowiak M, Girnholc M, Banasiuk R i in. (2014). Combination of silver nanoparticles and Drosera binata
extract as a possible alternative for antibiotic treatment of burn wound infections caused by resistant
Staphylococcus aureus. PLOS ONE 9(12):e115727.
5) Khan MR, Timi D (1999). Constituents of Diospyros lolin, D. maritima and D. novoguinensis. Fitoterapia 70:194196.
6) Putalun W, Udomsin O, Yusakul G i in. (2010). Enhanced plumbagin production from in vitro cultures of Drosera
burmanii using elicitation. Biotechnol. Lett. 32:721-724.
7) Ziaratnia SM, Kunert KJ, Lall N (2008). Elicitation of 7-methyljuglone in Drosera capensis. South African J. Botan.
75:97-103.
8) Machado TB, Pinto AV, Pinto MC i in. (2003). In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring
naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrob.
Agents 21:279-284.
9) Banasiuk R, Kawiak A, Królicka A (2012). In vitro cultures of carnivorous plants from the Drosera and Dionaea
genus for the production of biologically active secondary metabolites. BioTechnologia 93:87-96.
10) de Paiva SR, Figueiredo MR, Aragão TV, Kaplan MA (2003). Antimicrobial activity in vitro of plumbagin
isolated from plumbago species. Mem Inst. Oswaldo Cruz 98:959-961.
11) Cowan MM (1999). Plant Products as Antimicrobial Agents. Clin. Microbiol. Rev. 12:564-582.
12) Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.
Physiol Plant 15:473–497.