Mechanizm upośledzenia biosyntezy kolagenu w przebiegu

Mechanizm upośledzenia biosyntezy kolagenu w przebiegu

-ECHANIZMUPOuLEDZENIABIOSYNTEZYKOLAGENUWPRZEBIEGU
DOuWIADCZALNEGOSTARZENIAFIBROBLASTÌWSKÌRYLUDZKIEJ
-ECHANISMOFCOLLAGENBIOSYNTHESISINHIBITIONDURINGEXPERIMENTALAGING
OFFIBROBLASTS
$RNFARM7OJCIECH-ILTYK$RNFARM%WA+ARNA
0ROFDRHABNFARM*ERZY!0AŒKA
:AKŒAD#HEMIII!NALIZY,EKÌW
!KADEMIA-EDYCZNAW"IAŒYMSTOKU
STRESZCZENIE
Mechanizm upośledzenia podziałów fibroblastów i biosyntezy kolagenu w skórze w przebiegu procesu starzenia nie jest w pełni poznany. Jednym z enzymów odgrywających ważną rolę w biosyntezie kolagenu i wzroście
fibroblastów jest prolidaza [E.C.3.4.13.9]. Przeprowadzono badania porównawcze aktywności prolidazy
i zawartości zewnątrzkomórkowego (ECM) kolagenu
w hodowli fibroblastów skóry ludzkiej poddanych eksperymentalnemu starzeniu. Wykazano, że w przebiegu
tego procesu następuje jednoczesne obniżenie zawartości ECM kolagenu i aktywności prolidazy. Korelacja
pomiędzy obydwoma parametrami jest dwufunkcyjna.
Obniżenie aktywności prolidazy przyczynia się do obniżenia zawartości kolagenu w ECM, natomiast usunięcie
zewnątrzkomórkowego kolagenu w hodowli fibroblastów upośledza aktywność prolidazy w tych komórkach. Mechanizm tego zjawiska, stanowiący przedmiot
dyskusji w niniejszej pracy, polega na pobudzeniu aktywności i ekspresji prolidazy za pośrednictwem sygnału indukowanego przez receptor integrynowy (prawdopodobnie β1), pobudzony przez interakcję z kolagenem
typu I. Wyniki przedstawionych badań sugerują, że obniżenie podziałów komórkowych i zawartości kolagenu
w skórze w przebiegu starzenia jest wynikiem upośledzenia aktywności i ekspresji prolidazy.
Słowa kluczowe
starzenie, prolidaza, fibroblast, macierz pozakomórkowa, kolagen.
'˜ ւ
Jedną z charakterystycznych zmian towarzyszących
procesowi starzenia organizmu jest upośledzenie biosyntezy kolagenu i jego zawartości w tkankach [1]. Fibroblasty
skóry w hodowli komórkowej syntetyzują głównie kolagen
typu I i III w stosunku około 3:1 oraz o wiele mniejsze ilości kolagenu typu VI [2,3]. W przebiegu starzenia w skórze
następuje obniżenie zawartości fibroblastów, wzrost populacji komórek nie dzielących się oraz obniżenie ekspresji
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
ABSTRACT
The mechanism related to the decrease number of fibroblasts in the dermis during aging and decrease in the
biosynthetic capacity of existing fibroblasts to produce
collagen is not known.
Since prolidase [E.C.3.4.13.9] has been found to play
an important role in the recycling of proline for collagen
synthesis and cell growth we performed the comparative studies on prolidase activity and extracellular collagen content in in vitro aged human skin fibroblasts. We
have found that during aging of human skin fibroblasts
there is the coordinate decrease of prolidase activity and
extracellular collagen content. The correlation is bifunctional. Decrease in prolidase activity contributes to decrease of extracellular collagen content and removal of
extracellular collagen from cultured fibroblasts contributes to decrease of fibroblast`s prolidase activity. The
mechanism of this phenomenon, that is discussed in this
paper, is probably due to regulation of prolidase activity
and expression through signal induced by β1 integrin
receptor. Extracellular type I collagen, known ligand for
β1 integrin receptor, is probably responsible for the β1
integrin activation. Our results demonstrate that during
in vitro aging of human skin fibroblasts there is decreased fibroblast`s prolidase activity. The phenomenon
may be related to the decrease number of fibroblasts
and decrease of extracellular collagen content in in vitro
aging of the cells.
Key words
aging, prolidase, fibroblasts, extracellular matrix, collagen.
wielu genów kodujących białka pozakomórkowe, takie jak
np. kolagen [4]. Mechanizm powyższych zjawisk nie jest
w pełni poznany.
Obserwacje poczynione w niniejszej pracy sugerują, że
obniżenie zawartości pozakomórkowego kolagenu w hodowli fibroblastów poddanych doświadczalnemu starzeniu
mogą być następstwem obniżenia aktywności prolidazy
w przebiegu tego procesu.
Prolidaza [E.C.3.4.13.9] jest cytoplazmatyczna egzopeptydazą katalizująca proces hydrolizy imidodipeptydów za-
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
wierających C-końcową prolinę lub hydroksyprolinę (głównie glicylo-L-prolinę lub glicylo-L-hydroksyprolinę) [5,6,7].
Enzym ten jest szeroko rozpowszechniony w tkankach ludzi
i zwierząt i obficie występuje w wielu komórkach, w tym
w fibroblastach [8,9]. Prolidaza katalizuje końcowy etap degradacji kolagenu i odgrywa ważną rolę w dostarczaniu proliny
do procesu syntezy kolagenu [10,11] i wzrostu komórek [12].
Niedobór prolidazy jest chorobą uwarunkowana genetycznie, charakteryzującą się imidodipeptydurią, zaburzeniami metabolizmu skóry, częstymi infekcjami, upośledzeniem funkcji układu immunologicznego oraz upośledzeniem
umysłowym [5,7]. W hodowli fibroblastów pochodzących
od pacjentów z niedoborem prolidazy zaobserwowano
wzrost degradacji kolagenu oraz obniżenie wewnątrzkomórkowej puli proliny [13]. Szereg dowodów doświadczalnych
wskazuje, że prolidaza może służyć jako ważny potranslacyjny modulator syntezy i degradacji kolagenu. Zachodzi
przypuszczenie, że enzym ten może odgrywać ważną rolę
w procesach związanych ze starzeniem organizmu. Z tego
względu podjęto badania porównawcze oceny aktywności
prolidazy i zawartości kolagenu w hodowli fibroblastów
skóry ludzkiej poddanych doświadczalnemu starzeniu.
- R–l-t¬ŸlŸuR |J¬
MATERIAŁY
Prolina, glicylo-prolina, glicylo-hydroksyprolina, metionylo-prolina, fenyloalanylo-prolina, bakteryjna kolagenaza (typ
VII), elastaza, trypsyna i podłoże Eagle`a otrzymano z Sigma Chemical, podobnie jak większość użytych odczynników.
Płodowa surowica bydlęca pochodziła z Gibco, a aminokwasy
(non essential aminoacids) z Quality Biologicals Inc. Płytki hodowlane pokryte kolagenem typu I, typu IV, lamininą lub fibronektyną otrzymano z Collaborative Biomedical Products. L-5
[3H]-proliną (28 Ci/mmol) otrzymano z Amersham.
HODOWLA KOMÓRKOWA
Fibroblasty skóry ludzkiej (CRL-1474) otrzymane
z American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA,
hodowano na płytkach Costar w podłożu Eagle`a zawierającym 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, non essential aminoacids, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml
streptomycyny w 37°C w atmosferze 5% CO2. W większości
doświadczeń komórki hodowano w 6. oczkowych płytkach
Costar, używając 1 x 105 komórek w 2 ml podłoża hodowlanego na oczko i inkubowano do stanu inhibicji kontaktowej.
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PROLIDAZY
Aktywność prolidazy oceniono metodą Myara i wsp. [14]
która opiera się na pomiarze proliny przy użyciu odczynnika
Chinard`a [15]. Komórki poddano trzykrotnemu płukaniu
0.15 mol/L NaCl, zeskrobano z powierzchni płytki i odwirowano (200xg). Komórki zeskrobane z 6 oczek zawieszono w
0.3 ml 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.8, poddano homogenizacji
ultradźwiękowej (3 razy po 10 sekund w 0°C). Próby poddano ultrawirowaniu (80,000 x g, 15 min.) w 4°C. Supernatant
użyto do pomiaru zawartości białka i aktywności prolidazy.
Aktywacja prolidazy wymaga preinkubacji z jonami manganu. W tym celu 100 μl supernatantu inkubowano przez
24 godziny w temp. 370C ze 100 μl 0.05 mol/L Tris-HCl,
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
pH 7.8, zawierającego 2 mmol/L MnCl2. Po inkubacji reakcję zapoczątkowano przez dodatek 100 μl mieszaniny inkubacyjnej do 100 μl 94 mmol/L glicylo-proliny (Gly-Pro)
do uzyskania końcowego stężenia dipeptydu 47 mmol/L. Po
kolejnej inkubacji przez 1 godzinę w 37°C, reakcję przerywano przez dodatek 1 ml 0.45 mol/L kwasu trichlorooctowego. Uwolnioną prolinę oznaczano przez zmieszanie 0.5
ml mieszaniny reakcyjnej z 2 ml mieszaniny 1:1 składającej
się z lodowatego kwasu octowego i odczynnika Chinarda
(25 g ninhydryny w 600 ml lodowatego kwasu octowego
i 400 ml 6 mol/L kwasu ortofosforowego). A następnie inkubowanie przez 10 min. w 90°C. Ilość uwolnionej proliny
oznaczano kolorymetrycznie przy 515 nm i kalkulowano na
podstawie krzywej kalibracyjnej sporządzonej przy użyciu
standardowych roztworów proliny. Zawartość białka mierzono metodą Lowry. Aktywność enzymu przedstawiono
jako ilość nanomoli proliny uwolnionej z syntetycznego
substratu w ciągu 1 minuty w przeliczeniu na miligram białka zawartego w mieszaninie enzymatycznej.
PREPARATYKA MACIERZY POZAKOMÓRKOWEJ (ECM)
Macierz pozakomórkową (ECM), znakowaną izotopem,
pozbawioną komórek przygotowano według zmodyfikowanej metody Jones’a i wsp. [16]. Komórki zawieszone
w podłożu hodowlanym naniesiono w ilości 1 x 105 komórek/oczko w 6 oczkowych płytkach i hodowano przez 3 dni.
Następnie do podłoża hodowlanego dodawano 1 μCi/ml
L-[5-3H] proliny (28Ci/mmol) i inkubowano przez kolejne
3 dni. Po tym okresie komórki płukano trzykrotnie PBS,
następnie PBS z 0.5% Triton X-100 przez 10 min. w celu usunięcia komórek oraz 30 min. w 0.25 mol/L NH4OH
w celu usunięcia elementów szkieletu komórkowego. ECM
przytwierdzoną do powierzchni płytki płukano 3 krotnie
PBS. Analiza obrazu z mikroskopu świetlnego nie wykazała
pozostałości komórek na płytce.
ANALIZA SKŁADNIKÓW ECM
ECM znakowaną 5-[3H] proliną analizowano w celu
określenia proporcji pomiędzy glikoproteinami, elastyną
i kolagenem. Pomiaru zawartości tych składników ECM
dokonano poprzez traktowanie ECM trypsyną, elastazą
i kolagenozą bakteryjną. W celu zaabsorbowania elastazy
zanieczyszczającej trypsynę roztwór tego enzymu (10 ml
0.05% roztworu) inkubowano z 5 mg elastyny bydlęcej
przez 30 min. w 37°C. Następnie zawiesinę nierozpuszczalnej elastyny odwirowano, a supernatant użyto do dalszych
doświadczeń. Enzymów użyto w stężeniu 10 μg/ml w 0.1
mol/L Tris-HCl, pH 7.6 zawierającym 10 mmol/L CaCl2.
Po inkubacji ECM w temp. pokojowej ilość radioaktywności uwolnionej w wyniku inkubacji z trypsyną, elastazą
bądź kolagenazą mierzono w liczniku scyntylacyjnym.
ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ BIAŁEK
NA ŻELU POLIAKRYLOAMIDOWYM W OBECNOŚCI SDS-U
Fibroblasty płukano trzykrotnie 0,15 mol/l NaCl, zawieszano w 0,15 mol/l NaCl i wirowano przy obrotach 200 x g.
Odwirowane komórki zawieszono w 0,3 ml 0,05 mol/l buCOPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
foru Tris-HCl o pH 7,8 i poddano działaniu ultradźwięków
trzykrotnie po 10 sekund w temp. 0°C. Próby wirowano
przy 16.000 x g w temp. 0°C przez 30 minut. W uzyskanym
supernatancie oznaczono białko metodą Lowry i użyto do
dalszych doświadczeń.
Zastosowano 10% żel rozdzielający, zawierający 0,4%
SDS, 1,5 mol/l Tris-HCl pH 8,8; 6% żel zagęszczający zawierający 0,4% SDS, 0,5 mol/l Tris-HCl pH 6,8 oraz roztwór 1,92 mol/l glicyny, 0,25 mol/l Tris i 1% SDS jako bufor
elektrodowy. Próbkę rozpuszczono w buforze zawierającym: 0,125 mol/l Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS, 20% glicerolu i 0,1% błękitu bromofenolowego. Rozdział prowadzono
stosując aparat Mini-PROTEAN 3 firmy Bio-Rad Laboratories. Na żel nanoszono około 20 μl próby zawierającej 20 μg
białka. Elektroforeza trwała 1 godzinę przy natężeniu prądu
100 mA na żel. Po jej zakończeniu żel poddawano transferowi na nitrocelulozę i następnie barwiono 0,125% roztworem „Coomassie Brilant Blue” R-250 w mieszaninie: propan-2-ol, kwas octowy, woda (25:10:65, v:v:v). Odbarwiano
w wodnym roztworze zawierającym 10% kwasu octowego
i 10% propan-2-olu.
Użyto SeeBlue 2 (Invitrogen) jako standardów mas cząsteczkowych.
ANALIZA BIAŁEK METODĄ „WESTERN IMMUNOBLOT”
Po rozdziale elektroforetycznym żele zostały zrównoważone przez 5 minutową inkubację w 20% (v/v) metanolowym roztworze zawierającym 25 mmol/l Tris i 0,2 mol/
l glicyny. Białka transferowano na nitrocelulozę o porach
0,2 μm przy użyciu zestawu Multiphor II, pod wpływem
napięcia 100 mA przez 1 godzinę, według metody opisanej
w podręczniku dołączonym do aparatu. Pozycje standardów
oznaczano markerem S&S NC (Schleicher i Schuel), a następnie odbarwiano roztworem TBS-T (20 mmol/l bufor
Tris-HCl o pH 7,4 zawierający 150 mmol/l NaCl i 0,05%
Tweed 20). Niespecyficzne wiązanie białek do nitrocelulozy
zablokowano poddając ją działaniu 5% roztworu beztłuszczowego mleka w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze
pokojowej. Następnie nitrocelulozę inkubowano z pierwszym przeciwciałem króliczym przeciw prolidazie ludzkiej
w stężeniu 1:1000 w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji nitrocelulozę płukano w roztworze TBS-T (1 x 15 minut, 2 x 10 minut) wolno mieszając. Następnie dodawano drugie przeciwciało poliklonalne
przeciw immunoglobulinie króliczej, znakowane alkaliczną
fosfatazą w stężeniu 1:3000 w TBS-T i poddawano inkubacji przez 30 minut, wolno mieszając. Następnie nitrocelulozę delikatnie płukano TBS-T (1 x 15 minut, 4 x 10 minut)
i poddawano działaniu odczynnika Sigma-Fast BCIP/NBT
w celu wybarwienia immunoreaktywnego białka znakowanego fosfatazą alkaliczną.
ANALIZA STATYSTYCZNA
Obliczono wartości średnie z 6 pomiarów ± S.D. Wyniki
poddano analizie matematycznej używając test “t” Studenta
przy P < 0.05.
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
¬A‡Ÿ Ÿ |–Rq-Ao-Ÿ ‚|ulÖJ®¬Ÿ ®-ª-– |²Alԟ p|q-aRy¥Ÿ ªŸ Ÿ
lŸ-p ¬ªy|²Alԟ‚–|qlJ-®¬ŸªŸ‚–®R7lRa¥ŸJ|²ªl-JA®-qyRa|Ÿ˜ -k
–®Ryl-Ÿ]7–|7q-˜ }ª ˜p}–¬ q¥J®plRo‡ ֘ |²É p|u}–Rp ª ˜ -k
ylRŸlyil7lAolŸp|y -p |ªRoŸªŸi|J|ªqlŸª¬y|˜lt-Ÿ¡‡¡Ÿ‹Ÿ°‡Ÿ«Ÿ°^Ÿ
ž|A®p|Ÿ ‚t¬ pl‡Ÿ –|ARy Ÿ p|q-aRy¥Ÿ Ÿ |7qlA®|y|Ÿ ªŸ ˜‚|˜}7Ÿ
|‚l˜-y¬ŸªŸ–|®J®l-qRŸu- R–l-t¬ŸlŸuR |J¬‡Ÿp ¬ªy|²ÉŸ‚–|qlJ-k
®¬Ÿ|ARyl-y|ŸªŸp|u}–p-AiŸ‚|Ai|J®ÔA¬AiŸ®Ÿ¡Ÿ|A®Rp‡Ÿ
¬A‡Ÿ ¤Ÿ Ÿ p ¬ªy|²ÉŸ ‚–|qlJ-®¬Ÿ ªŸ ]7–|7q-˜ -Ai ˜p}–¬ q¥J®plRo
ªŸ˜ -ylRŸlyil7lAolŸp|y -p |ªRoŸ„‚-˜-¸Ÿ^…Ÿ‚|JJ-y¬AiŸ –-ªlRk
yl¥ŸRy®¬u-ulŸ‚–| R|ql ¬A®y¬ulŸªŸ˜ Ö¸Ryl¥Ÿ°Ÿwažuq‡Ÿ|u}–k
plŸªŸlq|²AlŸŸ«Ÿ°^žuqŸ°†Ÿ ŸªŸoRJy¬uŸ|A®p¥Ÿ‡Ÿ|A®p|ªRoŸ
‚t¬ plŸi|J|ª-y|ŸJ|Ÿ˜ -y¥Ÿlyil7lAolŸp|y -p |ªRoŸ„^‡ŸJ®lR͟i|k
J|ªql…‡Ÿ |Ÿ ¬uŸ A®-˜lRŸ p|u}–plŸ ‚t¥p-y|Ÿ ¡‡Ÿ p–| ylRŸ Ÿ lŸ lyk
p¥7|ª-y|ŸªŸŸuqŸ°‡Ÿu|qžŸ"–l˜kqGŸ‚Ÿœ‡GŸ®-ªlR–-oÔA¬uŸ
°Ÿuu|qžŸ-q¤Ÿ|–-®Ÿ|J‚|ªlRJylԟ‚–| R-®ÖŸªŸ¡œMŸ‚–®R®Ÿ
ª˜p-®-y¬Ÿ|p–R˜ŸA®-˜¥‡ŸŸ
'¬ylpl
Fibroblasty skóry ludzkiej poddano charakterystyce pod
względem aktywności prolidazy w zależności od liczby
pasażu komórek. W przebiegu doświadczalnego starzenia
komórek (pomiędzy pasażem 8. i 16.) dokonano pomiaru
aktywności prolidazy w komórkach w stanie inhibicji kontaktowej. Jak wynika z Ryc. 1 aktywność prolidazy w komórkach pochodzących z pasaży 8-12 nie ulega zmianie.
Komórki pochodzące z wyższych pasaży (13.-16.) wykazują niższą aktywność prolidazy, tym niższą im wyższy pasaż
komórek. Komórki pochodzące z 16 pasażu wykazują zaledwie 25% aktywności tego enzymu w komórkach z pasażu
8.-12. Obniżenie aktywności prolidazy w przebiegu starze-
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
nia komórek koreluje z obniżeniem zawartości kolagenu
w ECM (Ryc. 1). Zawartość kolagenu w ECM syntetyzowanym przez komórki pochodzące z pasażu 16. stanowi
zaledwie 50 % zawartości kolagenu występującego w ECM
wytworzonej przez fibroblasty pochodzące z pasażu 8.-11.
Wpływ pozakomórkowego kolagenu na aktywność prolidazy przedstawiają wyniki eksperymentu przedstawione
na Ryc.2 Aktywność prolidazy mierzono w fibroblastach,
których skład białek ECM zaburzono poprzez usunięcie
glikoprotein (traktowanie trypsyną), elastyny (traktowanie
elastazą) i kolagenu (traktowanie kolagenozą). Wyniki badań przedstawione na Ryc.2 wskazują, że 6. godzinne traktowanie komórek kolagenazą bakteryjną przyczynia się do
obniżenia aktywności prolidazy około 30% wartości kontrolnych. Podobne traktowanie fibroblastów trypsyną lub
elastazą nie wywoływało takiego efektu.
Wiadomo, że wzrostowi gęstości komórek w hodowli towarzyszy wzrost produkcji kolagenu przez te komórki. Niniejsze badania wskazują, że wzrostowi gęstości komórek
w hodowli towarzyszy również wzrost aktywności prolidazy (Ryc.3). Podobne zjawisko zaobserwowano kiedy fibroblasty inkubowano na płytkach pokrytych różnymi białkami
ECM. Wyniki przedstawia Ryc. 4. Komórki o niskiej gęstości z typową niską aktywnością prolidazy, wzrastające
na płytce pokrytej kolagenem typu I, typu IV lub lamininą
wykazywały wzrost aktywności prolidazy. Fibronektyna nie
wpływała na aktywność tego enzymu.
Różnice w aktywności prolidazy obserwowane w przebiegu
doświadczalnego starzenia fibroblastów nie są wynikiem zmian
specyficzności substratowej enzymu. Tabela I przedstawia
wyniki badań dowodzące, że fibroblasty pochodzące z pasaży
12 i 16 wykazują tę samą specyficzność substratową.
¬A‡Ÿ¡Ÿ+-qR¸y|²ÉŸ-p ¬ªy|²AlŸ‚–|qlJ-®¬Ÿ|JŸa֘ |²AlŸp|u}–RpŸ
ªŸ i|J|ªql‡Ÿ ‡Ÿ l7–|7q-˜ ¬Ÿ „‚-˜-¸Ÿ `…Ÿ y-y|˜®|y|Ÿ y-Ÿ ‚t¬ p֟
ªŸ lq|²AlŸ Ÿ «Ÿ °^žuqŸ °†Ÿ Ÿ ªŸ oRJy¬uŸ |A®p¥Ÿ ‡|A®p|ªRoŸ
‚t¬ plŸlŸªŸ|J˜ ւ-AiŸ¤`Ÿa|J®lyy¬AiŸp|u}–plŸqlA®|y|ŸªŸiRk
u|A¬ |uR –®RŸlŸ|®y-A®-y|ŸªŸylAiŸ-p ¬ªy|²ÉŸ‚–|qlJ-®¬‡Ÿ‡Ÿ
p˜‚–R˜o-Ÿ‚–|qlJ-®¬Ÿª¬p|y-y-ŸuR |Jԟ'R˜ R–yŸq| ŸªŸ]7–|k
7q-˜ -AiŸ|Ÿ–}¸yRoŸa֘ |²AlŸp|u|–RpŸªŸi|J|ªql‡Ÿ‡Ÿp˜‚–R˜o-Ÿ
ʃk-p ¬y¬ŸªŸp|u}–p-AiŸ¥¸¬ ¬AiŸJ|Ÿ|ARy¬ŸRp˜‚–R˜olŸ‚–|qlJ-k
®¬GŸo-p|Ÿp|y –|q-Ÿ‚–|ARJ¥–¬Ÿy-y|˜®Ryl-Ÿ–}ªy|ª-¸y¬AiŸlq|k
²AlŸ7l-tp-ŸªŸp-¸JRoŸ‚–}7lR‡
¬˜p¥˜oFibroblasty odgrywają ważną rolę w prawidłowym
rozwoju i funkcjonowaniu niemal wszystkich tkanek i narządów człowieka. Odpowiedzialne są one za produkcję
ogromnej liczby różnych składników ECM. Jednym z najważniejszych składników ECM jest kolagen. Fibroblasty
skóry syntetyzują głównie kolagen typu I, III i VI [2,3].
W przebiegu starzenia fibroblasty tracą stopniowo zdolność
do podziałów komórkowych [17,18]. Utrata tej zdolności koreluje ze zmianami w ekspresji bardzo wielu genów,
w tym genów kolagenu różnych typów [4].
W niniejszych badaniach wykazano, że podczas starzenia
fibroblastów skóry ludzkiej następuje koordynacyjne obniżenie aktywności prolidazy i zawartości pozakomórkowego
"-7Rq-Ÿ‡Ÿ ‚RA¬]A®y|²É ˜¥7˜ –- |ª- ‚–|qlJ-®¬ ]7–|7q-˜ }ª
®Ÿ‚-˜-¸¥Ÿ¤ŸlŸ‡
-˜-¸Ÿ–
p ¬ªy|²ÉŸ–|qlJ-®¬Ÿ„yu|qžulyžua…
q¬k–|
iRk–|
q¬k¬‚
R k–|
¤Ÿ„yY…
¤¡UŸ‹Ÿœ
`¡Ÿ‹Ÿœ
œŸ‹Ÿ`
^Ÿ‹Ÿ¡
Ÿ„yY…
z¡Ÿ‹Ÿz5
UŸ‹Ÿ¡5
UŸ‹Ÿ¤5
^Ÿ‹Ÿ5
–®RJ˜ -ªl|y|Ÿª-– |²AlŸ²–RJylRŸŸ‹Ÿ ‡‡Ÿ®ŸqlA®7¬Ÿy‘Ÿi|J|ªqlŸ
p|u}–p|ª¬Ai
5ŸrŸ°‡°°
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
¬A‡Ÿ `Ÿ p ¬ªy|²ÉŸ ‚–|qlJ-®¬Ÿ ªŸ p|u}–p-AiŸ |Ÿ yl˜plRoŸ a֘ |k
²AlŸ y-y|˜®|y¬AiŸ ªŸ lq|²AlŸ Ÿ «Ÿ °^ž|A®p|Ÿ ‡Ÿ |A®p|ªRoŸ ‚t¬ plŸ
p|y –|qyRoŸ„…Ÿ|–-®Ÿ‚t¬ RpŸ‚|p–¬ ¬AiŸy-˜ ւ¥oÔA¬ulŸ7l-tp-ulŸ
Ÿ<p|q-aRyRuŸ ¬‚¥ŸŸ„¤…GŸp|q-aRyRuŸ ¬‚¥Ÿ&Ÿ„¡…GŸ]7–|yRpk
¬yԟ„`…GŸq-ulylyԟ„^…=GŸ-ŸŸy-˜ ւylRŸlyp¥7|ª-y¬AiŸ‚–®R®Ÿ¤`Ÿ
a|J®ly¬ŸªŸ‚|Jt|¸¥Ÿ‚|®7-ªl|y¬uŸ˜¥–|ªlA¬‡
kolagenu.
Końcowy etap degradacji kolagen jest katalizowany
przez prolidazę [EC.3.4.13.9], cytoplazmatyczny enzym
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
katalizujący hydrolizę dipeptydów z C-końcową proliną lub
hydroksyproliną [7]. Enzym ten odgrywa ważną rolę w obrocie proliny do procesu resyntezy kolagenu [10,11] i wzrostu komórek [12]. Obniżenie aktywności prolidazy w przebiegu starzenia wpływa zatem na upośledzenie podziałów
fibroblastów i biosyntezy kolagenu. Zjawisko to nasuwa
pytanie o mechanizm obniżania aktywności prolidazy w fibroblastach w przebiegu starzenia. Wyniki doświadczenia,
które ilustruje Ryc.2 sugerują, że usunięcie kolagenu z hodowli fibroblastów w stanie inhibicji kontaktowej poprzez
inkubację z kolagenazą bakteryjną przyczyniło się do obniżenia aktywności prolidazy do około 30% wartości kontrolnej. Podobne traktowanie komórek trypsyną lub elastazą
nie powodowało takiego efektu. Wynik tego doświadczenia
pozwala przypuszczać, że obniżenie zawartości kolagenu
w ECM jest przyczyną obniżenia aktywności prolidazy.
Kolagen stanowiący około 30% wszystkich białek organizmu jest niezbędny nie tylko jako białko podporowe w celu
utrzymania struktury tkanki łącznej ale również jako ligand
receptorów adhezyjnych. Interakcja pomiędzy receptorami
adhezyjnymi komórek a białkami ECM, takimi jak kolagen,
aktywuje szlaki sygnałowe w komórce przyczyniając się do regulacji ekspresji genów, różnicowania, wzrostu i wielu funkcji
metabolicznych komórki [19,20,21]. Wiadomo, że w wielu tych
funkcjach pośredniczą receptory integrynowe [22,23]. Prawdopodobnie interakcja receptora integrynowego z kolagenem stanowi mechanizm indukcji aktywności prolidazy.
Wyniki badań przedstawione na Ryc. 3 wskazują, że
wzrostowi gęstości komórek w hodowli towarzyszy zarówno wzrost aktywności jak i ekspresji prolidazy. Z literatury
oraz badań własnych wiadomo, że w miarę wzrostu gęstości
komórek w hodowli ich zdolność do biosyntezy kolagenu
wzrasta [24]. Najwyższą zdolność do biosyntezy kolagenu
wykazują fibroblasty w stanie inhibicji kontaktowej. Z tego
względu należy sądzić, że wzrost aktywności prolidazy w fibroblastach o wyższej gęstości komórek w hodowli jest wynikiem wzrostu zawartości zewnątrzkomórkowego kolagenu pobudzającego receptor integrynowy. Prawdopodobnie
wzrost aktywności tego enzymu jest następstwem wzrostu
jego ekspresji. Dalszych dowodów popierających przedstawiona hipotezę dostarczają badania, które ilustruje Ryc. 4.
Fibroblasty hodowane na płytce pokrytej różnymi białkami
ECM (zwłaszcza kolagenem typu I, IV i lamininą) wykazywały wzrost aktywności prolidazy. Ciekawe, że fibronektyna
stanowiąca ligand tych samych receptorów integrynowych
co kolagen, nie wykazywała takiego efektu. Z uwagi jednak
na fakt, że fibroblasty w hodowli syntetyzują głównie kolagen typu I, elastynę i fibronektynę [25] i nie syntetyzują
kolagenu typu IV ( ważnego składnika błon podstawnych)
można przypuszczać, że składnikiem ECM w hodowli fibroblastów pobudzającym aktywność prolidazy jest kolagen
typu I. Sugestia ta jest poparta przez szereg poprzednich badań [26, 27] jakkolwiek istnieją prawdopodobnie mechanizmy pobudzania biosyntezy kolagenu niezależne od receptorów integrynowych i aktywności prolidazy [28].
Istnieje wiele dowodów wskazujących, że mechanizmy
regulacyjne obserwowane w hodowlach komórkowych
maja miejsce również in vivo [25]. W procesie starzenia
skóra staje się coraz cieńsza oraz zmniejsza sie zawartość
kolagenu w tej tkance [1]. Ponadto następuje obniżenie iloCOPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†
ści fibroblastów w skórze i ich zdolności do biosyntezy kolagenu [25].
Wyniki przedstawionych badań wykazały, że w przebiegu doświadczalnego starzenia fibroblastów skóry ludzkiej
następuje obniżenie aktywności prolidazy. Zjawisko to jest
przyczyną obniżenia zdolności fibroblastów do podziałów
komórkowych i biosyntezy kolagenu. Zachodzi przypuszczenie, że aktywatory prolidazy mogą okazać się skutecznymi środkami farmakologicznymi przeciwdziałającymi
skutkom procesu starzenia skóry.
l²ulRyylA ª|
1. Shuster S, Black MM, McVitie E. The influence of age
and sex on skin thickness, skin collagen and density. Br
J Dermatol 1975; 93: 639.
2. Gay S, Martin GR, Müller PK, Timpl R, Kuhn K. Simultaneous synthesis of types I and III collagens by fibroblasts in culture. Proc Natl Acad Sci USA 1976; 73:
4037.
3. Hatamochi A, Aumailley M, Mauch C, Chu ML, Timpl
R, Krieg T. Regulation of collagen VI expression in
fibroblasts. Effects of cell density, cell-matrix interactions, and chemical transformation. J Biol Chem1989;
264: 3494.
4. Furth JJ. The steady state levels of type I collagen mRNA
are reduced in senescent fibroblasts. J Gerontol 1991;
46: B122.
5. Myara I, Charpentier C, Lemonnier A. Minireview: Prolidase and prolidase deficiency. Life Sciences 1984; 34:
1985.
6. Mock WL, Green PC, Boyer KD. Specificity and pH dependence for acylproline cleavage by prolidase. J Biol
Chem. 1990; 265: 19600.
7. Phang J M, Scriver CR. Disorders of proline and hydroxyproline metabolism. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly
WS, Valle D, eds. The metabolic basis of inherited disease, McGraw Hill New York; 1989: 577.
8. Myara I, Brosset B, Lemonnier A. Tissue distribution of
prolidase and prolinase activity in man and rat. Med Sci
Res 1987; 15: 965.
9. Endo F, Tanoue A, Nakai H, Hata A, Indo Y, Titani K,
Matsuda I. Primary structure and gene localization of
human prolidase. J Biol Chem 1989; 264: 4476.
10. Jackson SH, Dennies AW, Greenberg M. Iminopeptiduria. A genetic defect in recycling collagen: a method for
determining prolidase in red blood cells. Canad Med Assoc J 1975; 113: 759.
11. Jackson SH, Heininger JA. A reassessment of the collagen reutilization theory by an isotope ratio method. Clin
Chim Acta 1973; 46: 153.
12. Emmerson KS, Phang JM. Hydrolysis of proline dipeptides completely fulfills the proline requirement in a proline - auxotropic Chinese Hamster Ovary cell line. J Nutr
1993; 123: 909.
13. Chamson A, Voigtlander V, Myara I, Frey J. Collagen
biosynthesis anomalies in prolidase deficiency: effect of
glycyl-L-proline on the degradation of newly synthesized collagen. Clin Physiol Bioch 1989; 7: 128.
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
–Ÿ`ŸžŸ¤°°U
14. Myara I, Charpentier C, Lemonnier A. Optimal conditions for prolidase assay by proline colorimetric determination: application to imidodipeptiduria. Clin Chim Acta
1982; 125: 193.
15. Chinard FP. Photometric estimation of proline and ornithine. J Biol Chem 1952; 199: 91.
16. Jones PA, DeClerck YA. Destruction of extracellular matrices containing glycoproteins, elastin, and collagen by metastatic human tumor cells. Cancer Res 1980; 40: 3222.
17. Martin M, El Nabout R, Lafuma C, Crechet F, Remy
J. Fibronectin and collagen gene expression during in
vitro aging of pig skin fibroblasts. Exp Cell Res 1990;
191: 8.
18. Choi AMK, Olsen DR, Cook KG, Deamond SF, Uitto J,
Bruce SA. Differential extracellular matrix gene expression by fibroblasts during their proliferative life span in
vitro and at senescence. J Cell Physiol 1992 ; 151: 147.
19. Bissel M. How does extracellular matrix direct gene
expression? J Theor Biol 1981; 99: 31.
20. Donjacour AA, Cunha GR. Stromal regulation of epithelial function. Cancer Treat Res 1991; 53: 335.
21. Carey DJ. Control of growth and differentiation of vascular cells by extracellular matrix. Ann Rev Physiol
1991; 53: 161.
22. Akiyama SK, Nagata K, Yamada K. Cell surface receptors for extracellular matrix components. Biochim Biophys Acta 1990; 1031: 91.
23. Albelda SM, Buck CA. Integrins and other cell adhesion
molecules. FASEB J 1990; 4: 2868.
24. Mäkelä JK, Vuorio T, Vuorio E. Growth-dependent modulation of type I collagen production and mRNA levels
in cultured human skin fibroblasts. Biochim Biophys
Acta 1990; 1049:171.
25. Takeda K, Gosiewska A, Peterkofsky B. Similar, but
not identical modulation of expression of extracellular
matrix components during in vitro and in vivo aging of
human skin fibroblasts. J Cell Physiol 1992; 153: 450.
26. Pałka JA, Phang JM. Prolidase activity in fibroblasts
is regulated by interaction of extracellular matrix with
cell surface integrin receptors. J Cell Biochem 1997; 67:
166.
27. Surażyński A, Pałka J, Wołczyński S. Phosphorylation
of prolidase increases the enzyme activity. Mol Cell Biochem 2001; 220: 95.
28. Karna E, Miltyk W, Pałka JA. Butyrate-induced collagen biosynthesis In cultured fibroblasts is independent
on α2β1 integrin signaling and undergoes through IGF-I
receptor cascade. Mol Cell Biochem 2006; 286; 147.
Ÿ
&ARMACEUTYCZNY
0RZEGL’D.AUKOWY
COPYRIGHT‚'RUPA$R!2+WIECIÊSKIEGO
)33.†