Artykuł naukowy

Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów izolowanych z grzybów klasy
Basidiomycetes
Marta Kinga Lemieszek
[email protected]
Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi w Lublinie
Streszczenie
Grzyby z klasy Basidiomycetes stanowią cenne
źródło substancji biologicznie aktywnych, o
właściwościach przeciwnowotworowych. Atrybut ten przypisuje się przede wszystkim polisacharydom
oraz ich pochodnym. Potencjał przeciwnowotworowy wielocukrów związany jest z ich pochodzeniem,
składem i strukturą chemiczną, rozpuszczalnością oraz sposobem izolacji. Ich aktywność moŜe być
znacząco zwiększona na drodze modyfikacji chemicznych. Efekt przeciwnowotworowy polisacharydów
moŜe wynikać z działania pośredniego (immunostymulacja) lub bezpośredniego (hamowanie proliferacji
komórek i/lub indukcja apoptozy). Z pośród szerokiej gamy polisacharydów o udokumentowanych
właściwościach przeciwnowotworowych, na szczególną uwagę zasługują lentinan, PSK i schizophyllan.
Polisacharydy te są od wielu lat z powodzeniem wykorzystywane w terapii róŜnego rodzaju
nowotworów. Stosunkowo niewiele wiadomo natomiast o prozdrowotnych właściwościach bardzo
popularnych na półkuli północnej Boletus edulis (borowik szlachetny; prawdziwek) oraz Cantharellus
cibarius (pieprznik jadalny; kurka). Prezentowana praca przedstawia chemoprewencyjne właściwości
ekstraktów pozyskiwanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka okręŜnicy. Udowadniając
olbrzymi potencjał terapeutyczny wspomnianych grzybów.
Słowa kluczowe: Basidiomycetes, polisacharydy, lentinan, PSK, krestin, schizophyllan, Boletus edulis,
Cantharellus cibarius
WSTĘP
Korzyści zdrowotne wynikające ze spoŜycia grzybów znane są od tysięcy lat. W medycynie krajów
Dalekiego Wschodu (Chiny, Japonia, Korea, część azjatycka Rosji) stosuje się produkty z grzybów jako
suplementy diety lub jako leki od ponad 2000 lat [1]. Na Zachodzie, grzyby spoŜywano przede wszystkim
ze względu na ich walory smakowe i zapachowe. Jednak w ostatnich latach grzyby znalazły się w
centrum zainteresowania uczonych z całego świata jako źródło substancji biologicznie aktywnych o
korzystnym wpływie na funkcjonowanie organizmu człowieka. Efektem tych badań było wprowadzenie
na rynki światowe tzw. mykofarmaceutyków czy teŜ grzybowych suplementów diety. O skali i randze
tego zjawiska świadczy fakt, Ŝe grzyby jadalne zostały zaliczone do grupy produktów określanej mianem
„Ŝywności funkcjonalnej” – tj. Ŝywności o udokumentowanym badaniami naukowymi korzystnym
wpływie na zdrowie ponad ten, który wynika z obecności w nich składników odŜywczych tradycyjnie
uznanych za niezbędne [2-5].
Od wieków wiadomo, Ŝe niektórzy przedstawiciele grzybów z klasy Basidiomycetes (Podstawczaki)
posiadają właściwości przeciwnowotworowe. Po raz pierwszy zademonstrował je Lucas i wsp. [6] na
ekstrakcie sporządzonym z owocników Boletus edulis (borowik szlachetny) w teście z uŜyciem komórek
sarkoma 180 u myszy. Zespół Lucasa wyizolował równieŜ z Calvatia gigantea (purchawica olbrzymia)
calvacin, który w 1960 był najpopularniejszym produktem naturalnym izolowanym z grzybów
o
właściwościach przeciwnowotworowych [7]. Działanie calvacinu potwierdzono w komórkach Sarcoma
180, gruczolaka sutkowego 755, białaczki L-1210 oraz HeLa [4].
Pod względem chemicznym, z pośród licznych substancji biologicznie aktywnych o właściwościach
przeciwnowotworowych pozyskiwanych z grzybów, zdecydowaną większość stanowią polisacharydy [4,
8-12]. Głównym ich źródłem jest ściana komórkowa komórek grzybowych. Przy czym, jak wykazano w
badaniach,
chityna i chitosan nie posiadają aktywności antynowotworowej [13]. Pod względem
chemicznym większość polisacharydów grzybowych o właściwościach przeciwnowotworowych moŜna
zaliczyć do pochodnych (1→3), (1→6) β-glukanów oraz (1→3) α-glukanów [14]. Związki te zbudowane
są z linearnego lub rozgałęzionego łańcucha, utworzonego przez cząsteczki glukozy oraz z łańcucha
bocznego zawierającego róŜną kombinację innych cukrów prostych, głównie kwasu glikuronowego,
ksylozy, galaktozy, mannozy, arabinozy lub rybozy. Powszechne są równieŜ kompleksy białkowe.
Równie liczną grupę wielocukrów o właściwościach przeciwnowotworowych stanowią glukany, gdzie
cząsteczka wielocukru utworzona jest z innych niŜ glukoza monosacharydów. U grzybów, najczęściej
występują glukany zawierające w przewaŜającej mierze: arabinozę, mannozę, fukozę, galaktozę, ksylozę,
kwas glikuronowy jak równieŜ glukozę [12].
Struktura chemiczna a właściwości przeciwnowotworowe
W zaleŜności od źródła pochodzenia (kaŜdy gatunek a nawet szczep ma nieco inny zestaw wielocukrów),
polisacharydy róŜnią się strukturą chemiczną, masą cząsteczkową oraz sposobem i liczbą odgałęzień
łańcuchów bocznych, co wpływa na ich aktywność biologiczną. [15-18].
Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów zaleŜą od:
składu cukrów
Właściwości przeciwnowotworowe zostały wykazane dla polisacharydów naleŜących do hetero – βglukanów [19], heteroglikanów [20], kompleksów β-glukan białko [21], α-manno-β-glukany,
kompleksy α-glukan-białko [19] oraz kompleksy białko-heteroglikany [22, 23].
masy cząsteczkowej
Glukany o wyŜszej masie cząsteczkowej wydają się być bardziej skuteczne niŜ te o małej masie
cząsteczkowej [8- 10, 13].
rozpuszczalności w wodzie
Z reguły, większą aktywność wykazują polisacharydy rozpuszczalne w wodzie [24].
sposobu połączenia cząsteczek cukrów
Wykazano, Ŝe właściwości przeciwnowotworowe posiadają glukany, w których łańcuch główny
złoŜony jest z reszt glukozowych połączonych wiązaniami β-(1→3) glikozydowymi, a dodatkowo
występują rozgałęzienia utworzone przez wiązania β-(1→6) glikozydowe. β-glukany posiadające
głównie wiązania β-(1→6) glikozydowe charakteryzują się mniejszą aktywnością [8-10].
struktury trzeciorzędowej
Wykazano, Ŝe zniszczenie struktury trzeciorzędowej polisacharydów poprzez denaturację, znacznie
obniŜa lub całkowicie znosi ich aktywność biologiczną [25-27].
sposobu i liczby odgałęzień łańcuchów bocznych
Wykazano, Ŝe najwyŜszą aktywnością charakteryzują się polisacharydy ze stopniem odgałęzienia w
zakresie 0,20-0,33 w stosunku do masy cząsteczkowej [16, 17, 28, 29].
obecności innych podstawników
Na właściwości przeciwnowotworowe korzystnie wpływa obecność innych cukrów np. galaktozy,
mannozy, fruktozy, ksylozy czy arabinozy. Dodatkowo, aktywność przeciwnowotworową nasila
obecność białka [13].
modyfikacji chemicznych
Aktywność przeciwnowotworową polisacharydów moŜna zwiększyć poprzez chemiczne modyfikacje
mające na celu zwiększenie ich rozpuszczalności w wodzie i zdolności do przenikania przez ściany
jelita po ich doustnym podaniu. Najczęściej stosowane modyfikacje to degradacja Smitha (hydroliza
utleniająco-redukująca), aktywacja metodą formolizy czy karboksymetylacji [8, 9, 23, 30-33].
Najpopularniejsze preparaty przeciwnowotworowe pozyskiwane z Podstawczaków
Bogatym
i
wciąŜ
niezbadanym
do
końca
źródłem
polisacharydów
o
właściwościach
przeciwnowotworowych są grzyby z klasy Podstawczaków (Basidiomycetes). Potwierdzają to zakrojone
na szeroką skalę badania uczonych z Chin i Japonii, którzy wykazali, Ŝe większość jeśli nie wszystkie
Podstawczaki zawierają biologicznie aktywne polisacharydy. Badania zostały wykonane na zwierzętach z
Sarkomą 180 oraz
guzami Ehrlicha [11]. Do tej pory najlepiej scharakteryzowane zostały trzy
polisacharydy, które od blisko 50 lat dostępne są na rynku tj. lentinan, PSK (krestin) i schizophyllan [8,
34].
Lentinan jest wysoce oczyszczoną frakcją polisacharydową izolowaną z Lentinus edodes (Shiitake). Pod
względem struktury chemicznej jest to ß-glukan, w którym łańcuch główny utworzony jest z cząsteczek
glukozy połączonych wiązaniami β-(1→3) glikozydowymi, zaś odgałęzienia boczne stanowią cząsteczki
glukozy połączone z łańcuchem głównym wiązaniami β-(1→6)
glikozydowymi [9]. Lentinan jest
powszechnie stosowany w Japonii, gdzie został zalegalizowany jako lek przeciwnowotworowy.
Podawany jest łącznie z innymi konwencjonalnymi farmaceutykami w terapii nowotworów m.in.
wątroby, Ŝołądka, jelita, płuca i jajnika. Wykazano, Ŝe lentinan zwiększa skuteczność konwencjonalnej
terapii a tym samym wydłuŜa przeŜycie pacjentów [35]. W badaniach eksperymentalnych wykazano, Ŝe
podawanie lentinanu zapobiega onkogenezie indukowanej chemicznie lub przez wirusy, jak równieŜ
zapobiega procesom przerzutowania [25, 36-38].
Krestin (PSK) jest polisacharydem izolowanym z Trametes versicolor. Poza częścią cukrową którą
stanowi β-glukan, w skład cząsteczki PSK wchodzi równieŜ peptyd. Część cukrową stanowi łańcuch
główny utworzony przez cząsteczki glukozy połączone wiązaniami β-(1→3)
oraz β-(1→4)
glikozydowymi, w odgałęzieniach bocznych występują wiązania β-(1→6) glikozydowe [9]. Podobnie
jak lentinan, krestin jest bardzo popularnym lekiem stosowanym w Japonii. Liczne badania kliniczne
wykazały, Ŝe jego podawanie zwiększa skuteczność chemioterapii u pacjentów cierpiących na nowotwory
piersi, wątroby, prostaty, Ŝołądka, płuca i okręŜnicy. Samodzielnie, jako lek stosowany jest w weterynarii
m.in. przeciwko nowotworom płuca, jelita grubego oraz sarkomie, mastocytomie i czerniakowi [35].
Schizophyllan pozyskiwany jest z Schizophyllum commune. Pod względem struktury chemicznej tj.
składu cukrów oraz sposóbu ich połączenia, przypomina lentinan. Komercyjna nazwa tego ß-glukanu to
Sonifilan [9]. Preparat ten stosowany jest w terapii raka Ŝołądka i szyi [2]. Dodatkowo, jest podawany w
trakcie radioterapii ze względu na swoje radioprotekcyjne właściwości związanych z pobudzaniem
proliferacji i regeneracji uszkodzonych promieniowaniem gamma komórek szpiku kostnego [39-41].
Polisacharydy pozyskiwane z innych grzybów w obrębie klasy Basidiomycetes równieŜ wykazują
działanie prozdrowotne. Liczne doniesienia naukowe potwierdziły ich zdolności do zapobiegania
karcynogenezie, przerzutowaniu oraz hamowaniu rozwoju juŜ istniejących zmian nowotworowych [25,
36-38].
Mechanizm działania
RóŜnorodność struktury polisacharydów i ich pochodnych ma swoje odzwierciedlenie w róŜnorodności
mechanizmów ich działania. Ogólnie moŜna wyróŜnić dwa podstawowe mechanizmy działania
polisacharydów na komórki nowotworowe: wpływ pośredni poprzez immunostymulację oraz bezpośredni
poprzez hamowanie ich wzrostu oraz indukcję apoptozy.
I Działanie pośrednie
Oddziaływanie pośrednie polega na stymulacji mechanizmów obronnych gospodarza, przede wszystkim
na aktywacji limfocytów T i B, makrofagów i komórek NK [15, 16, 18, 28]. Wiele grzybowych βglukanów posiada zdolność pobudzania wytwarzania interferonu, interleukin i innych cytokin
stanowiących pierwszą linię obrony układu odpornościowego gospodarza, pozwalając na skuteczną
eliminację komórek transformowanych nowotworowo na długo przed wystąpieniem w pełni rozwiniętej
odpowiedzi humoralnej i komórkowej [42].
Badania wykazały, Ŝe β-glukany indukują odpowiedź organizmu poprzez wiązanie się z receptorami
błonowymi komórek immunologicznie kompetentnych [43]. Jednym z najwaŜniejszych receptorów dla βglukanów jest receptor CR3 (syn. Mac-1, CD11b/CD18) [44, 45]. Receptor ten, występuje powszechnie
na powierzchni komórek układu odpornościowego, przede wszystkim makrofagów, neutrofilów, komórek
NK i K. CR3 ma zdolność rozpoznawania opsoniny iC3b, która bardzo często występuje na powierzchni
komórek nowotworowych. Do pobudzenia aktywności Ŝernej
fagocytów dochodzi w wyniku
jednoczesnego przyłączenia do receptora CR3 składnika dopełniacza iC3b (opsonina) oraz β-glukanu a
brak któregoś z tych komponentów uniemoŜliwia indukcję cytotoksyczności [44, 46, 47]. Polisacharydy
zwiększają więc zdolność komórek układu odpornościowego do rozpoznawania jako obce komórek
nowotworowych, a tym samym zwiększają skuteczność mechanizmów obronnych gospodarza [48].
Polisacharydy, których immunostymulacyjne właściwości zostały najlepiej udokumentowane, to
wspomniane juŜ wcześniej lentinan, PSK i schizophyllan.
Lentinan
Badania wykazały, Ŝe lentinan stymuluje proliferację jednojądrzastych komórek krwi tj. limfocytów,
monocytów i makrofagów [49, 50]. Ponad to, pobudza on równieŜ dojrzewanie i róŜnicowanie komórek
zaangaŜowanych w mechanizmy obronne gospodarza. Lentinan jest równieŜ w stanie zwiększyć
reaktywności komórek układu odpornościowego oraz pobudzić je do wydzielania cytokin, hormonów
i/lub innych substancji biologicznie aktywnych. Dzięki opisanym właściwościom, lentinan zwiększa
oporność organizmu na transformację nowotworową [51, 52]. Lentinan został opisany jako adiuwant
ukierunkowany na limfocyty T [53]. Przesuwa on równowagę Th1/2 w kierunku Th1 poprzez znaczący
wzrost produkcji IL-12 [54]. Wpływa równieŜ na monocyty/makrofagi nasilając fagocytozę, a poprzez
aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κβ zwiększa wydzielanie niektórych cytokin, szczególnie TNFα [55, 56]. Zaobserwowano równieŜ jego stymulujący wpływ na populację komórek NK [57]. Liczne
dowody wskazują, Ŝe lentinan stymuluje komórki dendrytyczne, co ma istotne znaczenie dla
immunomodulacji i aktywności przeciwnowotworowej tego preparatu. Komórki dendrytyczne we
współpracy z komórkami K odgrywają kluczowa rolę w eliminacji komórek nowotworowych [52].
Dodatkowo zaobserwowano, Ŝe u pacjentów cierpiących na raka Ŝołądka, podawanie lentinanu
powodowało
inhibicję
syntezy prostaglandyn prowadzącą w wielu przypadkach do spowolnienia
róŜnicowania limfocytów T, jak równieŜ hamowania aktywności limfocytów Treg [49]. Jednocześnie w
śledzionie obserwowano zwiększenie poziomu zaktywowanych i cytotoksycznych limfocytów T [50]
oraz stymulację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej do wytwarzania IL-1α, IL-1β i TNF-a [52].
Zdolność lentinanu do stymulacji wytwarzania IL-1 została udowodniona równieŜ w innych typach
nowotworów [51]. Poza tym opisano wiele innych interesujących biologicznych aktywności lentinau
m.in. nasilenie niespecyficznej odpowiedzi zapalnej przejawiające się stymulacją produkcji białek ostrej
fazy [58] i hamowaniem układu dopełniacza [54].
Krestin (PSK)
Wykazano, Ŝe PSK pobudza zarówno składniki odporności komórkowej jak i humoralnej [59]. Po
podaniu w obręb guza, obserwuje się bezpośrednie interakcje PSK z komórkami nowotworowymi i
indukcję mechanizmów odpowiedzi zapalnej prowadzącej ich eliminacji [60]. U pacjentów, którym
podawano PSK, zaobserwowano wzrost ilości komórek immunologicznie kompetentnych oraz
zwiększenie zdolności komórek dendrytycznych oraz limfocytów Tc do infiltracji guza. Ponad to, krestin
wpływa na dojrzewanie fenotypowe i funkcjonalne ludzkich komórek dendrytycznych z komórek CD14+
[61], a takŜe stymuluje aktywność fagocytarną makrofagów [41]. Wykazano, Ŝe PSK indukuje ekspresję
genów dla TNF-α, IL-1, IL-8, IL-6 [62-65]. Cytokiny te wywołują reakcje prowadzące do stymulacji
cytotoksyczności limfocytów T względem komórek nowotworowych, nasilania wytwarzania przeciwciał
przez limfocyty B, czy teŜ indukcji ekspresji receptorów dla IL-2 na limfocytach T [63]. Badania
wskazały, Ŝe antynowotworowe działanie PSK opiera się na jego zdolności do stymulacji limfocytów T
oraz komórek prezentujących antygen, co pozwala na skuteczne rozpoznanie komórek nowotworowych i
ich niszczenie [59, 66].
Schizophyllan
Shizophyllan, budową a takŜe mechanizmem działania bardzo przypomina lentinan. Antynowotworowe
działanie tej substancji opiera się na modulacji odpowiedzi immunologicznej [66]. Podobnie jak lentinan,
shizophyllan wykazuje aktywność antynowotworową jedynie w obecnosci limfocytów T, co zostało
udowodnione w badaniach in vivo przeprowadzonych na myszach z sarcomą 180. Zwierzętom podano
cyklosporynę A będącą supresorem limfocytów T, co spowodowało zniesienie antynowotworych
właściwości obu preparatów [67, 68]. Schizophyllan stymuluje wytwarzanie białek ostrej fazy oraz CSF,
w efekcie czego dochodzi do pobudzenia proliferacji makrofagów, jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej i limfocytów a takŜe do stymulacji układu dopełniacza [69]. Poza tym, preparat ten zwiększa
produkcję limfocytów Th i makrofagów [69]. Charakteryzuje się równieŜ silną aktywacją komórek
Ŝernych, powodujac wzrost produkcji reaktywnych form tlenu, cytokin prozapalnych jak IL-6, IL-8 i
TNF-α. Zwiększa równieŜ ekspresję cząsteczek CD11b i CD69L na powierzchni leukocytów [70, 71].
II Działanie bezpośrednie
Poza wpływem pośrednim, wiele polisacharydów wykazuje bezpośrednie działanie na komórki
nowotworowe. Liczne badania in vitro i in vivo wskazują, Ŝe polisacharydy hamują proliferację komórek
nowotworowych i/lub indukują ich śmierć na drodze apoptozy [16, 17, 28, 29, 72].
Jednym z najlepiej opisanych mechanizmów bezpośredniego, przeciwnowotworowego działania
polisacharydów pozyskiwanych z Podstawczaków jest modulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego
NF-ĸβ. Nadmierna aktywacja NF-κB jest obserwowana w wielu typach nowotworów. Aktywny NF-κB
promuje wzrost guza przez zwiększenie transkrypcji genów, które indukują proliferację, wykazują
działanie antyapoptotyczne, czy teŜ promują angiogenezę i przerzutowanie [73]. Wykazano, Ŝe
polisacharydy hamują fosforylację i/lub degradację inhibitora NF-κB (IĸBα) [4, 19, 28, 74-77], co
uniemoŜliwia aktywację czynnika transkrypcyjnego a w konsekwencji ekspresję podległych mu genów
[78, 79].
Poza modulacją szlaku NF-ĸβ, polisacharydy mogą równieŜ w inny sposób oddziaływać na komórki
nowotworowe. Znakomitym przykładem jest tutaj kompleks polisacharydowo-białkowy tzw. PSP
pozyskiwany z Trametes versicolor. Wykazano, Ŝe w komórkach białaczki U-937 oraz komórkach raka
piersi MDA-MB-231, PSP powodował zatrzymanie cyklu komórkowego w punktach restrykcyjnych
G1/S oraz G2/M, jak równieŜ hamował aktywność białek antyapoptotycznych powodując zahamowanie
podziałów komórkowych i nasilenie apoptozy [80, 81]. Natomiast w komórkach białaczki HL-60 PSP
wywoływał podobny efekt poprzez indukcje spadku poziomu czynnika NF-κB i ekspresji kinaz ERK
[81].
BADANIA WŁASNE
Ciekawym
i
obiecującym
obiektem
do
poszukiwania
polisacharydów
o
właściwościach
przeciwnowotworowych wydają się być grzyby jadalne Boletus edulis (prawdziwek) i Cantharelus
cibarius (kurka). Jedno z pierwszych badań nad leczniczymi właściwościami grzybów dotyczyło właśnie
borowika szlachetnego. Inicjatorem badań był Lucas i wsp., którzy z pozytywnym skutkiem wykorzystali
ekstrakt z owocników borowika w leczeniu raka u myszy [4]. Po blisko 20 latach Ohtsuka i wsp.,
przebadali pod katem właściwości przeciwnowotworowych polisacharydy izolowane z róŜnych grzybów
w obrębie kasy Podstawczaków, w tym równieŜ pochodzących z kurki i prawdziwka. Wykazali
właściwości przeciwnowotworowe frakcji polisacharydowych pozyskiwanych z tych grzybów w
stosunku do guza Erlicha i Sarkomy 180 u myszy [8]. Od tamtych czasów nikt nie podjął się próby
izolacji polisacharydów z tych grzybów oraz charakterystyki ich aktywności biologicznej. Dziwi to w
świetle ogromnej popularności tych grzybów zarówno w kontekście ich występowania (gatunki
kosmopolityczne, powszechnie występujące na całej półkuli północnej), jak równieŜ spoŜycia - oba
gatunki są cenione za walory smakowe i zapachowe.
Celem naszych badań była ocena chemoprewencyjnego potencjału frakcji polisacharydowych
izolowanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka okręŜnicy. Nowotworu, który stanowi jedną z
najczęstszych przyczyn zgonów na nowotwory złośliwe i zapadalność na którego niestety ciągle się
zwiększa [82, 83]. Wybór przedmiotu badań był podyktowany równieŜ naturą schorzenia, gdzie
szczególną rolę w przeciwdziałaniu rozwojowi choroby pełni profilaktyka a przede wszystkim
odpowiednia dieta. W tym kontekście grzyby jadalne wydają się być idealnym kandydatem do badań.
Stanowią one nie tylko smaczny i poŜywny składnik diety, ale równieŜ dzięki bogactwie substancji
aktywnych w nich zawartych, wywierają korzystny wpływ na wiele procesów zachodzących w
organizmach Ŝywych.
Materiały i metody
Linie komórkowe
HT-29 linia wyizolowana z gruczolakoraka jelita grubego 44-letniej kobiety rasy Kaukaskiej
(stadium I według skalali Dukesa)
LS180 linia wyizolowana z gruczolakoraka jelita grubego 58-letniej kobiety rasy Kaukaskiej
(stadium II według skalali Dukesa)
CCD 841 CoTr linia ludzkich, nabłonkowych komórek jelita, unieśmiertelniona fenotypowo
wraŜliwym na temperaturę mutantem wirusa SV40. Komórki zostały pobrane z ludzkiego płodu w 21
tygodniu ciąŜy.
Linie HT-29 oraz LS180 pochodzą z ECACC (European Collection of Cell Cultures, Center for Applied
Microbiology and Research, Salisbury, UK). Z uwagi na cechy morfologiczne i funkcjonalne są
uznawane jako reprezentatywne dla stransformowanego nowotworowo nabłonka jelita grubego. Linia
CCD 841 CoTr pochodzi z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection, Menassas, VA, USA)
Do hodowli komórek poszczególnych linii uŜyto następujących podłóŜ hodowlanych:
•
linia HT29 i LS180 - podłoŜe DMEM + F12 HAM (Dulbecco Modified Essential Medium +
Nutrient Mixture F12 MAM) (1:1) (Sigma)
•
linia CCD 841 CoTr - podłoŜe DMEM (Dulbecco Modified Essential Medium) (Sigma)
PodłoŜa hodowlane uzupełniono o antybiotyki: penicylinę (100 j/ml) (Sigma) i streptomycynę (100
µg/ml) (Sigma), dodatkowo wzbogacono w płodową surowicę bydlęcą (FBS) (Sigma) w ilości 10%.
Komórki hodowano w wilgotnej atmosferze powietrza + 5% CO2, w temperaturze 37ºC (HT29 i LS180)
oraz w 33ºC (CCD 841 CoTr).
Otrzymywanie frakcji polisacharydowych
Grzyby wykorzystane do przygotowania próbek zostały zebrane w sadzie kasztanowym (w Macedo de
Cavaleiros oraz w lesie mieszanym sosnowo-dębowym w Vila Real (41o 19´ N i 7o 44´ W, 479 m npm) w
Portugalii. Identyfikacja grzybów i potwierdzenie ich przynaleŜności do gatunków Boletus edulis i
Cantharellus cibarius zostało wykonane przez specjalistę z dziedziny mikologii. Reprezentacyjne próbki
zebranych gatunków grzybów zostały złoŜone w zielniku mykologicznym University of Trás-os-Montes e
Alto Douro. Frakcje polisacharydowe BE1-4 i CC1-6 zostały otrzymane i przygotowane do analiz
biologicznych w
Chemistry Department, University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real
(Portugalia).
Liofilizowane grzyby Boletus edulis i Cantharellus cibarius ekstrahowano wrzącym 80% etanolu, w celu
eliminacji związków niskocząsteczkowych nierozpuszczalnych w alkoholu. Następnie mieszaniny
ekstrahowano gorącą wodą i dializowano (punkt odcięcia 10-15 kDa), co pozwoliło na uzyskanie
rozpuszczalnych w wodzie frakcji bogatych w związki wysokocząsteczkowe w tym w polisacharydy. W
celu oddzielenia polisacharydów obojętnych od glikoprotein, uzyskane frakcje poddano oczyszczaniu za
pomocą chromatografii jonowymiennej na kolumnach XK16/20 (szerokość 1,6 cm, długość 20 cm)
(Pharmacia) wypełnionych Q-Sepharose FF, jako eluentu uŜyto buforowanego roztworu octanu sodu 5
mM, pH 4,5 zawierającego 0,02% azydek sodu. W pierwszym etapie frakcje WSM (1 mg/ml) zostały
naniesione na kolumnę, po czym kolumna został przemyta buforem startowym w ilości odpowiadającej 4
krotnej objętości kolumny lub w ilości przy której mierzona przy długości fali 280 nm absorbancja
osiągnęła poziom startowy. Zatrzymane na kolumnie substancje były wymywane w warunkach elucji
gradientowej z zastosowaniem coraz to bardziej stęŜonych roztworów NaCl: 0-500 mM NaCl przez 5 h,
500-1000 mM NaCl 3 h, 1000-2000 mM NaCl 2 h. W trakcie elucji zbierano frakcje (po 2 ml), w których
oznaczano całkowitą zawartość cukrów metodą fenol-kwas siarkowy oraz odczytano absorbancję przy
długości fali 280 nm (białko). Następnie odpowiednie frakcje zostały połączone i poddane dializie (punkt
odcięcia 12-14 kDa), po czym zostały on zliofilizowane. Otrzymano 5 frakcji polisacharydowych z
Cantharellus cibarius (oznaczone jako CC1-6) oraz cztery frakcje z Boletus edulis (oznaczone jako BE14). Celem określenia struktury pierwszorzędowej polisacharydów obecnych w badanej frakcji, poddano je
kwaśnej hydrolizie. W tym celu 2-5 mg zliofilizowanej próbki zawieszono w 1 M kwasie siarkowym i
utrzymywano w stanie wrzenia przez 2.5 h. Po hydrolizie do roztworu dodane 0.5 ml 2-deoksyglukozy
(1mg/ml) jako standard wewnętrzny. Następnie roztwór rozcieńczono 10 krotnie i poddano właściwemu
oznaczeniu z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii jonowej z pulsacyjną detekcją
amperometryczną HPLC-PAD. Oznaczenie wykonano na aparacie ICS-300 (Dionex), z wykorzystaniem
kolumn CarboPac PA-20 zaopatrzonych w prekolumny CarboPac PA20. Jako eluent wykorzystano 5 mM
roztwór NaOH zawierający 2 mM Ba(OH)2
Liofilizowane frakcje zawierające rozpuszczono w soli fizjologicznej do końcowego stęŜenia 10 mg/ml.
Tak przygotowane roztwory wyjściowe przechowywano w temp. 4°C. Roztwory właściwe, bezpośrednio
uŜywane w doświadczeniach otrzymano przez rozcieńczenie roztworów wyjściowych w płynach
hodowlanych z dodatkiem FBS.
Określanie aktywności antyproliferacyjnej frakcji polisacharydowych – test MTT
Test opracowano
do określenia proliferacji i Ŝywotności komórek w obecności substancji o
właściwościach
cytostatycznych
i
cytotoksycznych.
dehydrogenaza
mitochondrialna
redukuje
Ŝółty,
W
komórkach
rozpuszczalny
w
aktywnych
wodzie
metabolicznie
MTT
(bromek
dimetylotetrazoliowy) do niebieskiego formazanu, który w postaci nierozpuszczalnych w wodzie
kryształów gromadzi się w komórkach. Do rozpuszczenia formazanu wymagane jest uŜycie detergentu
rozbijającego błonę komórkową i jednocześnie rozpuszczającego barwnik, w tym celu stosuje się bufor
SDS – HCl o pH 7.4. StęŜenie uwolnionego barwnika mierzy się spektrometrycznie. Intensywność barwy
jest wprost proporcjonalna do ilości Ŝywych komórek.
Na płytki 96-dołkowe wylano komórki linii LS180 i HT-29 o gęstości 3 × 104 kom/ml w płynie
hodowlanym z 10% FBS. Po 24 godzinach inkubacji z płytek delikatnie usunięto płyn hodowlany i
dodano roztwory badanych substancji w płynie hodowlanym z dodatkiem 10% FBS (po 100 µl na dołek).
W oznaczeniu uŜyto frakcji o stęŜeniach: 1; 10; 50; 100; 250 µg/ml.
Komórki hodowano 96 godzin w 37ºC w inkubatorze z 5% przepływem CO2. Po tym czasie określono
efekt działania badanych substancji za pomocą testu MTT. W tym celu do kaŜdego z dołków na płytkach
96-dołkowych dano po 15 µl roztworu MTT (o stęŜeniu 5 mg/ml w PBS z jonami Ca2+ i Mg2+). Po 3
godzinach inkubacji w temp. 37°C, do kaŜdego dołka dodano 100 µl buforu SDS-HCl o pH 7.4. Płytki
umieszczono na 24 godziny w inkubatorze (37ºC, 5% CO2). Następnie odczytano gęstość optyczną przy
długości fali 570 nm przy uŜyciu czytnika do mikropłytek ELx800 Absorbance Microplate Reader
(BioTek).
Oznaczanie cytotoksyczności frakcji polisacharydowych – test LDH
Oznaczenie zawartości dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie hodowlanym pobranym znad
hodowli potraktowanej badaną substancją pozwala ocenić cytotoksyczny wpływ preparatów na komórki.
Substancje toksyczne uszkadzają ich błony komórkowe i w konsekwencji powodują uwalnianie do
płynu hodowlanego składników cytoplazmy, m.in. dehydrogenazy mleczanowej (enzym szlaku
oddychania beztlenowego). Ilość LDH uwolnionego do podłoŜa hodowlanego jest proporcjonalna do
ilości komórek z uszkodzoną błoną komórkową. Metoda opiera się na redukcji NAD do NADH przez
komórkową LDH. Powstały NADH reaguje z barwnikiem tetrazoliowym, który przekształca się w
formazan, czemu towarzyszy zmiana barwy. NatęŜenie barwy jest proporcjonalne do ilości LDH
uwolnionego z komórek, a tym samym do ilości uszkodzonych komórek. Intensywność zabarwienia
mierzy się spektrofotometrycznie.
Na płytki 96-dołkowe wylano komórki linii CCD 841 CoTr o gęstości 1 × 105 kom/ml w płynie
hodowlanym z 10% FBS. Po 24 godzinnej inkubacji, ostroŜnie usunięto płyn znad hodowli a w jego
miejsce wprowadzono po 100 µl/dołek roztworów substancji badanych w płynie z 2% FBS. W
oznaczeniu uŜyto frakcji o stęŜeniach: 1, 10; 50; 100; 250 µg/ml.
Po 24 godzinnej inkubacji, znad hodowli poddanych działaniu ekstraktów pobrano po 50 µl płynu
hodowlanego i przeniesiono na nowe płytki 96-dołkowe, które wykorzystano do przeprowadzenia testu.
Test przeprowadzono przy uŜyciu komercyjnego zestawy „In Vitro Toxicology Assay Kit Lactate
Dehydrogenase Based”, zgodnie z instrukcją producenta.
Analiza wyników
Wyniki opracowywano przy uŜyciu programów Graph Pad Prism 5.0, Microsoft Office Excel 2003 oraz
KCJunior. Wyniki przedstawiono jako wartość średnią ± SD (odchylenie standardowe). Istotność
statystyczną między próbami badanymi a kontrolą określono przy pomocy jednoczynnikowego testu
ANOVA z testem post-hoc. Tukey’a. Za próg istotności statystycznej przyjęto p < 0.05.
Wartość IC50 (stęŜenie powodujące zahamowanie proliferacji o 50% w stosunku do kontroli) wyliczono
metodą Litchfielda i Wilcoxona [84].
Wyniki i dyskusja
W pierwszej kolejności sprawdzono cytotoksyczność ekstraktów na komórkach prawidłowych linii
CCD841 (ludzkie, komórki nabłonka jelita grubego) za pomocą komercyjnego zestawu: In vitro
Toxicology Assay Kit Lactate Dehydrogenase Based (Sigma, St. Louis, USA).
śaden z ekstraktów w analizowanym zakresie stęŜeń (od 1 do 250 µg/ml) nie był toksyczny w stosunku
do komórek prawidłowych nabłonka jelita grubego (Wykres 1.).
Wykres 1. Cytotoksyczność ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus
cibarius (CC1-CC6) względem komórek linii CCD841 po 24 h inkubacji z podłoŜem hodowlanym
(kontrola) lub badanymi ekstraktami w stęŜeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w
porównaniu z kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) – test: one-way ANOVA, post
test: Tukey.
Zdolność frakcji polisacharydowych do hamowania proliferacji komórek nowotworowych sprawdzono
za pomocą testu MTT na dwóch liniach ciągłych pochodzących z raka jelita grubego HT29 oraz LS180.
Wyniki testu MTT wskazują, Ŝe wszystkie badane frakcje w całym zakresie analizowanych stęŜeń
hamowały proliferację komórek raka okręŜnicy linii LS180 oraz HT-29 a efekt ich działania był zaleŜny
od dawki. Z pośród ekstraktów izolowanych z Cantharellus cibarius najsilniejsze działanie
antyproliferacyjne zaobserwowano w przypadku ekstraktu CC5. IC50 (stęŜenie powodujące
zahamowanie proliferacji o 50% w stosunku do kontroli) dla HT29 wyniosło 11,1 µg/ml, natomiast dla
LS180 2,6 µg/ml. W przypadku ekstraktów izolowanych z Boletus edulis najsilniejsze działanie
antyproliferacyjne zaobserwowano po zastosowaniu ekstraktu BE3, IC50 dla HT-29 wyniosło 26,8
µg/ml, a dla LS180 1 µg/ml (Wykres 2. i 3.).
Wykres 2. Wpływ ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus cibarius
(CC1-CC6) na proliferację komórek linii LS180 po 96 h inkubacji z podłoŜem hodowlanym (kontrola)
lub badanymi ekstraktami w stęŜeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w porównaniu z
kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) – test: one-way ANOVA, post test: Tukey.
Wykres 3. Wpływ ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus cibarius
(CC1-CC6) na proliferację komórek linii HT-29 po 96 h inkubacji z podłoŜem hodowlanym (kontrola)
lub badanymi ekstraktami w stęŜeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w porównaniu z
kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) – test: one-way ANOVA, post test: Tukey.
Analiza struktury pierwszorzędowej polisacharydów obecnych w badanych frakcja wykazała, Ŝe frakcje o
największym potencjale terapeutycznym tj. BE3 oraz CC5 zawierały najmniejszą ilość monosacharydów
spośród wszystkich analizowanych ekstraktów (Tabela 1). Jednocześnie zawierały one największą ilość
niezidentyfikowanych komponentów cukrowych. Najprawdopodobniej to właśnie te związki są
odpowiedzialne za ich antynowotworowe właściwości. Identyfikacja ich moŜe przybliŜyć nas do
stworzenia skutecznego i bezpiecznego leku zapobiegającego i/lub hamującego rozwój raka jelita
grubego.
Tabela 1.
frakcja
BE1
BE2
BE3
BE4
BE5
CC1
CC2
CC3
CC4
CC5
CC6
Fuc
5,1
2,3
1,0
2,8
5,6
4,4
0,8
5,0
5,0
0,0
0,0
GluN
0,0
0,1
0,0
0,0
0,0
0,0
5,0
0,0
0,0
0,0
0,0
zawartość monosacharydów (%)
Gal
Glc
Man
nieznane
8,4
72
1,4
0,0
3,6
9,9
4,7
0,1
0,2
2,0
0,6
2,1
0,0
2,3
1,9
1,1
6,3
9,0
0,1
0,0
4,0
9,6
19
0,0
4,6
20
39
0,0
4,3
39
4,9
0,0
4,3
39
4,9
0,0
0,0
1,8
0,7
8,3
0,0
2,4
4,3
0,0
ŁĄCZNIE
87
21
6,0
8,1
21
37
64
53
53
2,4
6,7
PODSUMOWANIE
Przez wieki w świecie zachodnim grzyby były traktowane jedynie jako smaczne uzupełnienie diety.
Medycyna krajów Dalekiego Wschodu stworzyła podwaliny dla ich terapeutycznego wykorzystania.
Ostatnie półwiecze to okres rozkwitu nowej dziedziny medycyny - mykofarmakologi. Naukowe podejście
do substancji zawartych w grzybach pozwoliło na wyizolowanie z nich wielu cennych substancji
aktywnych, które znalazły zastosowanie w profilaktyce oraz terapii chorób cywilizacyjnych, w tym
nowotworów.
Nasz
zespół
jako
pierwszy
wykazały przeciwnowotworowy potencjał
frakcji
polisacharydowych izolowanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka jelita grubego. Ze
względu na właściwości antyproliferacyjne oraz niską toksyczność w stosunku do komórek prawidłowych
jelita grubego analizowane substancje wydają się być atrakcyjnym kandydatami na suplementy diety/leki
przeciw nowotworom jelita grubego. Osiągnięcie tego celu wymaga jednak identyfikacji i charakterystyki
chemicznej składników odpowiedzialnych za antyproliferacyjnej właściwości ekstraktów oraz potwierdzenia
ich aktywności w badaniach in vivo oraz w badaniach klinicznych. Niemniej jednak zanim zostaną
zakończone kosztowne i długotrwałe procedury wdroŜenia nowych substancji terapeutycznych nie pozostaje
nam nic innego jak włączyć do naszej codziennej diety prawdziwki i kurki.
Piśmiennictwo
1. Chang ST, Buswell JA. Mushroom nutriceuticals. World J Microb Biotech 1996; 12: 473-476
2. Hobbs ChL: Medicinal Mushrooms: An Exploration of Tradition, Healing and Culture, Botanica Press, Williams, OR, USA
1995
3. Rajewska J, Bałasińska B. Związki biologicznie aktywne zawarte w grzybach jadalnych i ich korzystny wpływ na zdrowie.
Postępy Hig Med Dosw 2004; 58: 352-357
4. Wasser SP, Weis AL. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes. Int J Med Mushr 1999; 1: 3162
5. Wasser SP, Weis AL. Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern
perspective. Critical Rev Immunol 1999; 19: 65-96
6. Lucas EH, Montesano R, Pepper MS, Hafner M, Sablon E. Tumor inhibitors in Boletus edulis and other
holobasidiomycetes. Antibiot Chemother 1957; 7: 1-4
7. Lucas EH, Byerrum M, Clarke DA, Reilly HC, Stevens JA, Stock CC. Production of oncostatic principles in vivo and in
vitro by species of the genus Calvatia. Antibiot Annu 1958; 6: 493-496
8. Mizuno T. Development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi. Foods Food Ingred J Jpn 1996; 167: 69-85
9. Mizuno T. The extraction and development of antitumoractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. Int J
Med Mushrooms 1999; 1: 9-29
10. Mizuno T. Bioactive substances in Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. (Yamabushitake), and its medicinal utilization. Int
J Med Mushrooms 1999; 1: 105-119
11. Reshetnikov SV, Wasser SP, Tan KK. Higher Basidiomycota as a source of antitumor and immunostimulating
polysaccharides. Int J Med Mushrooms 2001; 3: 361-394
12. Wasser SP. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Appl Microbiol
Biotechnol 2002; 60: 258-274
13. Mizuno T. Yamabushitake, Hericium erinaceum: bioactive substances and medicinal utilization. Food Rev Intern 1995; 11.
173-178
14. Gorin PAJ, Barreto-Berger E. The chemistry of polysaccharides of fungi and lichens. W: The polysaccharides. Aspinall
GO (red.). Academic Press, Orlando 1983; 365-409
15. Augustin J. Glucans as modulating polysaccharides:thei characteristics and isolation from microbiological sources.
Biologia 1998; 53(3): 277-282
16. Bao X, Duan J, Fang X, Fang J. Chemical modifications of the (1→3)-α -D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and
investigation of their physicochemical properties and immunological activity. Carbohydrate Res 2001; 336: 127-140
17. Tao Y, Zhang L, Cheung PCK. Physicochemical properties and antitumor activities of watersoluble native and sulfated
hyperbranched mushroom polysaccharides. Carbohydrate Res 2006; 341: 2261-2269
18. Zhang P, Cheung PCK. Evaluation of sulfated Lentinus edodes α–(1,3)-D-glukan as a potential antitumor agent. Biosci
Biotechnol. Biochem 2002; 66(5): 1052-1056
19. Mizuno T, Saito H, Nishitoba T, Kawagishi H. Anti-tumoractive substances from mushrooms. Food Rev Int 1995; 11: 2361
20. Gao QP, Seljelid R, Chen HQ, Jiang R. Characterization of acidic heteroglycans from Tremella fuciformis Berk. with
cytokine stimulating activity. Carbohydr Res 1996; 288: 135-142
21. Kawagishi H, Kanao T, Inagaki R, Mizuno T, Shimura K, Ito H, Hagiwara T, Hakamura T. Formulation of a potent
antitumor (1→6)-beta-D-glucan-protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor activity of the resulting
products. Carbohydr Polym 1990; 12: 393-404
22. Zhuang C, Mizuno T, Shimada A et al. Antitumor protein-containing polysaccharides from a Chinese mushroom
Fengweigu or Houbitake, Pleurotus sajor-caju (Fr.) Sing. Biosci Biotechnol Biochem 1993; 57: 901-906
23. Mizuno T, Yeohlui P, Kinoshita T, Zhuang C, Ito H, Mayuzumi Y. Antitumor activity and chemical modification of
polysaccharides from Niohshimeji mushroom, Tricholoma giganteum. Biosci Biotechnol Biochem 1996; 60: 30-33
24. Manzi P, Pizzoferrato L. Beta-glucans in edible mushrooms. Food Chem 2000; 68(3): 315-318
25. Maeda YY, Watanabe ST, Chihara C, Rokutanda M. Denaturation and renaturation of a β-1,6; 1,3-glucan, lentinan,
associated with expression of T-cell-mediated responses. CancerRes 1988; 48: 671-675
26. Yanaki T, Ito W, Tabata K, Kojima T, Norizuye T, Takano N, Fujita H. Correlation between the antitumor activity of a
polysaccharide schizophyllan and its triple-helical conformation in dilute aqueous solution. Biophys Chem 1983; 17: 337-342
27. Yanaki T, Ito W, Tabata K. Correlation between antitumor activity of schizophyllan and its triple helix. Agric Biol Chem
1986; 509: 2415-2416
28. Ooi VEC, Liu F. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Curr Med Chem 2000;
7: 715-729
29. Zhang M, Cui SW, Cheung PCK, Wang Q. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation
process, structural characteristics and antitumor activity. Trends in Food Sci Technol 2007; 18: 4-19
30. Karácsonyi S, Kuniak L. Polysaccharides of Pleurotus ostreatus: isolation and structure of pleuran, an alkali-insoluble β-Dglucan. Carbohydr Polym 1994; 24: 107-111
31. Kuniak L, Karácsonyi S, Augusti J, Ginterová A, Széchényl S, Kravarik D, Dubaj J, Varjú J. A new fungal glucan and its
preparation. World Patent 9312243, Date of Patent 24.06.1993
32. Paulik S, Svrcec, Mojisová J, Durove A, Benisek Z, Húska M. The immunomodulatory effect of the soluble fungal glucan
(Pleurotus ostreatus) on delayed hypersensitivity and phagocytic ability of blood leucocytes in mice. J Vet Med B 1996; 43:
129-135
33. Zhuang C, Mizuno T, Ito H, Shimura K, Sumiya T. Chemical modification and antitumor activity of polysaccharides from
the mycelium of liquid-cultured Grifola frondosa. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 1994; 41: 733-740
34. Miles PG, Chang ST. Mushroom biology. Concise basics and current developments. World Scientific, Singapore, New
Jersey, London, Hong Kong 1997; 194
35.Mahajna JA, Yassin M, Wasser SP. Mushrooms extracts having anticancer activity. USA Patent US 7,258,862 B2, Date of
Patent 21.08.2007
36. Chihara G, Maeda Y, Hamuro J, Sasaki T, Fumiko F. Inhibition of mouse Sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus
edodes (Berk.)Sing. Nature 1969; 222: 687-688
37. Chihara G, Hamuro J, Maeda YY, Arai Y, Fukuoka F. Fractionation and purification of the polysaccharides with marked
antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes. Cancer Res 1970; 30: 2776-2781
38. Ikekawa T, Uehara N, Maeda Y, Nakanishi M, Fukuoka F. Antitumor activity of aqueous extracts of edible mushrooms.
Cancer Res 1969; 29: 734-735
39. Brown G, Siamon G. Immune recognition: A new receptor for β-glucans. Nature 2001; 413: 36-37
40. Herre J, Gordon S, Brown GD. Dectin-1 and its role in the recognition of β-glucans by macrophages. Mol Immunol 2004;
40: 869-876
41. Zhu D. Recent advances on the active components in Chinese medicines. Abstr Chin Med 1987; 1: 251-286
42. Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol
Med 1999; 221: 281-293
43. Czop JK, Austen KF. Properties of glycans that activate the human alternative complement pathway and interact with the
human monocyte beta-glucan receptor. J Immunol 1985; 135: 3388-3393
44. Ross GD, Vetvicka V, Yan J, Xia Y, Vetvickova J. Therapeutic intervention with complement and beta-glucan in cancer.
Immunopharmacology 1999; 42: 61-74
45. Xia Y, Vetvicka V, Yan J, Hanikyrova M, Mayadas T, Ross GD. The beta-glucan-binding lectin site of mouse CR3
(CD11b/CD18) and its function in generating a primed state of the receptor that mediates cytotoxic activation in response to
iC3b-opsonized target cells. J Immunol 1999; 162: 2281-2290
46. Vetvicka V, Thornton BP, Wieman TJ, Ross GD. Targeting of NK cells to mammary carcinoma via naturally occurring
tumor cellbound iC3b and beta-glucan-primed CR3 (CD11b/CD18). J Immunol 1997; 159: 599-605
47. Yan J, Vetvicka V, Xia Y, Coxon A, Carroll MC, Mayadas TN, Ross GD. Beta-glucan, a “specific” biologic response
modifier that uses antibodies to target tumors for cytotoxic recognition by leukocyte complement receptor type 3
(CD11b/CD18). J Immunol 1999; 163: 3045-3052
48. Hamuro J, Chihara G. Lentinan, a T-cell oriented immunopotentiator: its experimental and clinical applications and
possibile mechanism of immune modulation. W: Immunomodulation agents and their mechanisms. Fenichel RL, Chirigos MA
(red.). Dekker, New York 1985; 409-436
49. Aoki T. Lentinan. W: Immunology Studies: Immune modulation agents and their mechanisms. Femchel RL, Chirgis MA
(red.). 1984; 62-77
50. Hobbs C. Medicinal value of Lentinus edodes (Berk.) Sing. (Agaricomycetideae). A literature review. International Journal
of Medicinal Mushrooms 2000; 2: 287-302
51. Chihara G, Maeda YY, Taguchi T, Hamuro J. Lentinan as a host defence potentiator (HDP). International Journal of
Immunotherapy 1989; 5: 145
52. Chihara G. Immunopharmacology of Lentinan, a polysaccharide isolated from Lentinus edodes: its application as a host
defense potentiator. International Journal Oriental Medicine 1992; 17: 57-77
53. Wang GL, Lin ZB. The immunomodulatory effect of lentinan. Yao Xue Xue Bao 1996; 31: 86-90
54. Lull C, Wichers HJ, Savelkoul HFJ. Antiinflamatory and immunomodulating properties of fungal metabolites. Mediators
of inflammation 2005; 2: 63-80
55. Hamuro J. Anticancer immunotherapy with perorally effective lentinan. Gan To Kagaku Ryoho 2005; 32: 1209-1215
56. Kerekgyarto C, Virag L, Tanko L, Chihara G, Fachet J. Strain differences in the cytotoxic activity and TNF production of
murine macrophages stimulated by lentinan. Int J Immunopharmacol 1996; 18: 347-353
57. Takada K, Okumara K. CAM and NK cells. eCAM 2004; 1: 17-27
58. Suga T, Maeda YY, Uchida H, Rokutanda M, Chihara G. Macrophage-mediated acute-phase transport protein production
induced by Lentinan. International Journal of Immunopharmacology 1986; 8: 691
59. Tzianabos A. Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function. Clinical
Microbiology Reviews 2000; 13: 523-533
60. Mizutani Y, Yoshida O. Activation by the protein-bound polysaccharide PSK (krestin) of cytotoxic lymphocytes that act
on fresh autologous tumor cells and T24 human urinary bladder transitional carcinoma cell line in patients with urinary bladder
cancer. J Urol 1991; 145(5): 1082-7
61. Nio Y, Shiraishi T, Tsubono M, Morimoto H, Tseng CC, Imai S, Tobe T. In vitro immunomodulating effect of proteinbound polysaccharide PSK on peripheral blood, regional nodes, and spleen lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer
Imunol Immunother 1991; 32: 335-341
62. Hsieh TC, Wu JM. Cell growth and gene modulatory activities of Yunzhi (Windsor Wunxi) from mushroom Trametes
versicolor in androgen-dependent and androgen-insensitive human prostate cancer cells. Int J Oncol 2001; 18: 81-88
63. Kato M, Hirose K, Hakozak M et al. Induction of gene expression for immunomodulating cytokines in peripheral blood
mononuclear cells in response to orally administered PSK, an immunomodulating protein-bound polysaccharide. Cancer
Immunology and Immunotherapy 1995; 40: 152-156
64. Liu F, Fang MC, Ooi VEC, Chang ST. Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by
mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science 1996; 58: 1795-1803
65. Sakagami H, Sugaya K, Utsumi A, Fujinaga S, Sato T, Takeda M. Stimulation by PSK of interleukin-1 production by
human peripheral blood mononuclear cells. Anticancer Res 1993; 13: 671-675
66. Okazaki M, Adach Y, Ohno N, Yadomae T. Structure-activity relationship of (1-3)-β-Dglucan in the induction of cytokine
production from macrophages in vitro. Biological Pharmacological Bulletin 1995; 18: 1320-1327
67. Kraus J, Franz G. β(1-3) Glucans: anti-tumour activity and immunostimulation. W: Fungal Wall and Immune Response.
Latge JP, Boucias D (red.). NATO ASI Series H53, Springer, Berlin 1991; 39-42
68. Kraus J, Franz G. Immunomodulating effects of polysaccharides from medicinal plants. W: Microbial Infections. Friedman
H, Klein TW, Yamaguchi H (red.). Plenum Press, NewYork 1992; 299-308
69. Bohn JA, BeMiller JN. (1-3)-β-D-Glucans as biological response modifiers: a review of structure-functional activity
relationships. Carbohydrate Polymers 1995; 28: 3-14
70. Falch BH, Espevik T, Ryan L, Stokke BT. The cytokine stimulating activity of (1→3)-beta-Dglucans is dependent on the
triple helix formation. Carbohydr Res 2000; 329: 587-596
71. Kubala J, Ruzickova J, Nickova K, Sandula J, Ciz M, Lojek A. The effect of (1→3)-beta-D-glucans,
carboxymethyloglucan and schizophyllan on human leukocytes in vitro. Carbohydr Res 2003; 338: 2835-2840
72. Smith JE, Rowan NJ, Sullivan R. Medicinal mushrooms: a rapidly developing area of biotechnology for cancer therapy and
other bioactivities. Biotech Letters 2002; 24: 1839-1845
73. Ravi R, Bedi A. NF-kappa B in cancer-a friend turned foe. Drug Resist Update 2004; 7: 53-67
74. Ohno N, Miura NN, Nakajima M, Yadomae T. Anti-tumor 1,3-ß-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa. Biol
Pharm Bull 2000; 23: 866-872
75. Ohno N, Nameda S, Harada T et al. Immunomodulating activity of a ß-glucan preparation, SCG, extracted from a culinarymedicinal mushroom, Sparassis crispa Wulf. : Fr. (Aphyllophoromycetidae), and application to cancer patients. Int J Med
Mushr 2003; 5: 359-368
76. Yoshida I, Kiho T, Usui S, Sakushima M, Ukai S. Polysaccharides in fungi. XXXVII. Immunomodulating activities of
carboxymethylated derivatives of linear (1-3)-alpha-d-glucans extracted from the fruiting bodies of Agrocybe cylindracea and
Amanita muscaria. Biol Pharm Bull 1996; 19: 114-121
77. Yoshioka Y, Ikekawa T, Noda M, Fukuoka F. Studies on anti-tumor activity of some fractions from Basidiomycetes. I. An
anti-tumor acidic polysaccharide fraction of P. ostreatus (Fr.) Quél. Chem Pharm Bull 1972; 20: 1175-1180
78. Escárcega RO, Fuentes-Alexandro S, García-Carrasco M, Gatica A, Zamora A. The transcription factor nuclear factor-κB
and cancer. Clinical Oncology (Royal College of Radiologists (Great Britain)) 2007; 19(2): 154-61
79. Sheikh MS, Huang Y. Death receptor activation complexes: it takes two to activate TNF receptor 1. Cell Cycle 2003; 2(6):
550-2
80. Chow LW, Lo CS, Loo WT, Hu XC, Sham JS. Polysaccharide peptide mediates apoptosis by up-regulating p21 gene and
downregulating cyclin D1 gene. Am J Chin Med 2003; 31: 1-9
81. Hsieh T, Wu P, Park S, Wu JM. Induction of cell cycle changes and modulation of apoptogenic/anti-apoptotic and
extracellular signaling regulatory protein expression by water extracts of I'm-YunityTM (PSP). BMC Compl Altern Med, 2006
Sep 11
82. Bartnik Szczeklik A: Choroby wewnętrzne. T. 1. Medycyna praktyczna, Kraków 2005.
83. Hauser SC, Pardi DS, Poterucha JJ: Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review. Mayo Clinic Scientific
Press – Taylor & Francis Group, Rochester 2006.
84 Litchfield JT, Wilcoxon FA: A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J Pharmacol Exp Ther 1949, 96,
99-113