Część II - Wydział Chemii UW

Synteza związków znakowanych i ich
zastosowanie w chemii organicznej,
biochemii i medycynie
Część II
Prof. dr hab. Marianna Kańska
Metody syntezy związków znakowanych izotopami
1. Prosta synteza chemiczna.
2. Synteza na drodze wymiany izotopowej.
3. Synteza metodą atomów odrzutu.
4. Synteza w wyniku rozpadu β (beta).
5. Biosynteza.
6. Syntezy metodami enzymatycznymi.
W praktyce podstawowe znaczenie ma prosta synteza chemiczna,
biosynteza, synteza metodą wymiany izotopowej i metody enzymatyczne.
Właściwości syntezy związków znakowanych
Synteza związków znakowanych ma swoje specyficzne właściwości.
1. Substancją wyjściową do syntezy nie jest dowolny, najbardziej
odpowiedni związek, lecz związek otrzymywany w procesie
produkcji izotopu.
2. Ilości substancji stosowane do syntezy są małe, ponieważ ilości
izotopu promieniotwórczego jest ograniczona, a rozcieńczenie
substancją nieaktywną jest niepożądane, gdyż prowadziłoby do
zmniejszenia aktywności właściwej.
3. Ze względu na mikroskalę należy stosować specjalne techniki.
4. Podczas reakcji występują efekty radiacyjne.
5. Czas syntezy powinien być krótki.
Właściwości syntezy związków znakowanych (c. d.)
6. Nie powinno być reakcji ubocznych.
7. Syntezę należy prowadzić w warunkach odpowiadającym
przepisom BHP.
8. Należy opracować warunki syntezy na związkach nieaktywnych
tzn. przeprowadzić syntezę zimną.
a) W celu opracowania warunków syntezy.
b) W celu ustalenia totalnej wydajności:
- chemicznej,
- radiochemicznej.
Jednostki
tradycyjne:
1 Ci = 3,7 x 1010 rozp./sec
1 mCi = 3,7 x 107 rozp./sec
1 µCi = 3,7 x 104 rozp./sec
w układzie SI: 1 Bq = rozp./sec i wielokr. np. MBq = 106 Bq, GBq = 109 Bq
W wyniku pomiaru w otrzymujemy wynik w CPM (count per minute) lub
w DPM (decay per minute).
Aktywność właściwa
Aktywność na jednostkę masy np. mCi/mg, MBq/g
Aktywność molowa jest to aktywność przypadająca na jeden mol,
milimol, mikromol. Np. mCi/mole, DPM/mmole, MBq/mmol
Okres połowicznego rozpadu - T1/2
Jest to czas po upływie którego aktywność próbki zmniejsza się o połowę.
Synteza metodą wymiany izotopowej
• Wymianę izotopową stosuje się do otrzymywania związków organicznych
znakowanych izotopami wodoru, węgla, siarki i fluorowców.
• W celu przeprowadzenia syntezy należy zapewnić kontakt pomiędzy
wymieniającymi się substancjami, a następnie je rozdzielić.
• Metodą wymiany izotopowej można otrzymać takie związki, które nie
można zsyntezować na drodze klasycznej syntezy organicznej.
• Metodą wymiany izotopowej tylko w bardzo rzadkich przypadkach można
znakować związek w ściśle określonym miejscu.
Nomenklatura związków znakowanych
Stosuje się nazewnictwo związków zgodnie z regułami Konwencji
Genewskiej. Podaje się przy tym położenie danego izotopu w cząsteczce.
Korzysta się przy tym z niepełnego symbol chemicznego izotopu ( 14C, 13C,
125
I, 2H, 3H itd.).
Dla izotopów wodoru jest dopuszczalne użycie zamiast
2
H – D (deuter)
i
3
H – T (tryt)
Gdy pozycja izotopu jest nieokreślona używa się następujących
oznaczeń, jak np.
Kwas
14
C-propionowy
Kwas 3H-ascorbinowy
Nomenklatura związków znakowanych c.d.
W przypadku związków znakowanych izotopami wodoru lub węgla, gdzie atomy
danego izotopu są rozmieszczone w sposób przypadkowy po całym pierścieniu,
dopuszcza się jeszcze inny sposób zapisu.
COOH
NH2
[ring -14C]-L-fenyloalanina
Gdy atomy 14C są w przypadkowy sposób rozmieszczone w całej cząsteczce to:
COOH
NH2
[U- 14C]-L-fenyloalanina
(U-uniformely)
Nomenklatura związków znakowanych c.d.
Podobnie dla związków znakowanych izotopami wodoru
COOH
3
NH2
H
[ring-3H]-L-fenyloalanina
Związki równomiernie (niespecyficznie)
14
C lub izotopami wodoru
otrzymuje się głównie metodami klasycznej syntezy chemicznej lub w
wyniku biosyntezy. Wówczas w pożywce dla bakterii lub glonów
znajduje się 14CO2 lub woda trytowana, HTO lub deuterowana - DHO
lub D2O.
Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków
Rozpatrzymy to na przykładzie L-fenyloalaniny
COOH
NH2
[1-14C]-L-fenyloalanina – [114-C]-L-Phe
COOH
NH2
[3-14C]-L-Phe
3
H
COOH
3
H
NH2
[2’,6’-3H2]-L-Phe
* =
14
C
Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków c.d.
3
H
H
H
COOH
NH2
3
H
COOH
NH2
[3R-3H]-L-Phe
[3S-3H]-L-Phe
Związki znakowane podwójnie
3
H
14
COOH
Kwas 3-fenylo-[3-3H, 1-14C]-prop-2-enowy
lub
3
Kwas [3- H, 1-14C]-cynamonowy
Wymiana izotopowa
Metoda wymiany izotopowej jest szeroko stosowana do otrzymywania
związków organicznych znakowanych izotopami stabilnymi lub
radioaktywnymi. Polega ona na zapewnieniu kontaktu między dwoma
wymieniającymi się substancjami. Stosuje się przy tym podwyższoną
temperaturę, katalizatory itp. Tą metodą nie zawsze otrzymuje się związki
znakowane selektywnie
Głównie stosuje się wymianę izotopowa do otrzymania związków
znakowanych izotopami fluorowców lub wodoru.
Fluorowce (Cl2, Br2, I2), kwasy fluorowcowodorowe (HCl, HBr, HI) oraz
ich sole alkaliczne łatwo wchodzą w reakcję wymiany z fluorowcopochodnymi węglowodorów. Wymianę prowadzi się w roztworze lub w
stanie stopionym. I tak np.
RX
+
X2
C2H5Br
+
R X
Ag82Br
→ C2H582Br
+
XX
+ AgBr
Wymiana izotopowa c. d.
Za pomocą Li36Cl otrzymuje się chlorki alkilowe (butylu, heksylu) oraz
robenzen
Cl
∆
+ Li36Cl
CuO
36
Cl
+ LiCl
Otrzymywanie związków znakowanych 14C
CH314COONa
14
+ CH3COCl →
CO2
KCN →
+
CH3COONa + CH314COCl
K14CN + CO2
Otrzymywanie związków znakowanych 35S
(NH4)2CS
C6H5SH
+
S → (NH4)2C35S
tiomocznik
+
35
+ 35S
→
C6H5 35SH
+
S
S
36
Cl-chlo-
Znakowanie izotopami wodoru
Otrzymanie związków organicznych znakowanych izotopami wodoru w
miejscach labilnych (gdy atom wodoru jest związany z atomem azotu tlenu,
siarki) nie stanowi problemu, gdyż wymiana następuje szybko podczas
prostego kontaktu np. z wodą deuterowaną czy trytowaną. Jednak związki
znakowane w miejscach labilnych nie przedstawiają większej wartości w
badaniach chemicznych, ze względu na odwrotną wymianę izotopową i
stratę atomów znaczonych.
Wymiana atomów trytu czy deuteru w pozycjach trwałych (tj.
związanie go z atomem węgla w szkielecie cząsteczki) następuje w
specyficznych warunkach. Wymiana może przebiegać w podwyższonej
temperaturze, w warunkach katalizy kwaśnej lub zasadowej, często też
stosuje się jako katalizator sole platynowców.
Metoda Wiltzbacha
Do wprowadzenia trytu w skład cząsteczki stosuje się pewien rodzaj wymiany
izotopowej zwanej Wiltzbacha metodą.
Związek organiczny poddawany znakowaniu, rozpylony jest w postaci cieńkiego
filmu na ścianach naczynia, poddaje się działaniu gazowego 100% trytu.
W wyniku rekcji rozpadu jednego atomu trytu w cząsteczce gazowej powstaje
bardzo reaktywne indywiduum:
T
β
T
−
Τ
3
He
które wchodzi w reakcje ze związkiem poddawanym znakowaniu, RH wg reakcji:
Τ
3
He
+
T +
RX
RT
+
3
He
+
H
3
He
Wadą tej metody jest jej niespecyficzność, otrzymuje się [U-3H]-RH. Ze względu na
czas prowadzenia syntezy trzeba uwzględnić straty związane z radiolizą RH oraz
opracować metody oczyszczenia RX od produktów radiolizy.
Synteza związków znakowych trytem
Tryt na skalę przemysłową otrzymuje się:
- w postaci trytku uranu
- w postaci wody trytowej
- trytu
Tryt w trytku uranu nie zawiera protu (jest preparatem beznośnikowym).
Woda trytowa jest rozcieńczana wodą zwykłą, aby uniknąć znacznego
rozkładu wody trytowej pod wpływem własnego promieniowania
(autoradioliza).
Tryt wprowadza się w skład cząsteczek organicznych metodą prostej
syntezy chemicznej następującymi metodami:
1.
2.
3.
4.
Uwodornienie za pomocą trytu cząsteczkowego.
Uwodornienie za pomocą wodorku litowo-glinowego.
Hydroliza za pomocą wody trytowej.
Hydratacja.
Synteza związków znakowych trytem c.d.
• Atomy wodoru związane z tlenem, azotem, siarką w cząsteczkach
organicznych są ruchliwe (labilne).
• Wprowadzenie trytu na miejsce ruchliwego (labilnego) wodoru w
cząsteczce jest niepożądane, gdyż podczas badań taki atom trytu zostaje
utracony w wyniku wymiany izotopowej z rozpuszczalnikiem.
• Związki takie nie mogą być wykorzystane do badania mechanizmu
reakcji i kinetyki.
• Trudno ruchliwy (nielabilny) wodór występuje w węglowodorach i
grupach węglowodorowych.
• Dlatego też podstawowym zadaniem przy wprowadzeniu atomu trytu w
skład cząsteczek jest otrzymanie węglowodorów i ich pochodnych.
Synteza związków znakowych trytem c.d.
Węglowodory znakowane trytem otrzymuje się:
• Przez uwodornienie węglowodorów nienasyconych gazowym trytem w
obecności katalizatora.
• Przez redukcję dwutlenku węgla gazowym trytem.
Z wody trytowej:
• otrzymuje się [3H]-metan w wyniku rozkładu węgliku glinu przez HTO,
• [3H]- acetylen w wyniku rozkładu acetylenku wapnia przez HTO.
• Z odczynnika Grignarda w wyniku rozkładu przez HTO otrzymuje się
różnego rodzaju węglowodory alifatyczne oraz cykliczne.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca”
Metoda polega na reakcji tzw. atomów odrzutu z otaczającymi je
cząsteczkami. Atom odrzutu (posiadający dużą energię kinetyczną) powstaje
w wyniku rozpadu promieniotwórczego. Wówczas z jądra atomu wylatuje
lekka cząsteczka (neutron, elektron, α-cząstka) a jądro powstającego
pierwiastka jest “odrzucane” w stronę przeciwną otrzymując równoważną
porcje energii kinetycznej. Atomy odrzutu, w wyniku reakcji jądrowej, są też
wzbudzone na powłokach elektronowych, a więc bardzo reaktywne.
Do znakowania związków trytem wykorzystuje się reakcję:
6
Li(n, α)3H
W reaktorze sole litu (Li2CO3, Li2SO4, LiF) w mieszaninie ze związkiem
organicznym napromieniowuje się w strumieniu wolnych neutronów.
W trakcie syntezy 30-50% atomów trytu stabilizuje się w postaci wodoru
cząsteczkowego, H3H, 10-50% podstawia wodór w związku organicznym, a
reszta stabilizuje się w postaci innych związków.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.
Znakowanie węglem
Do znakowania 14C stosuje się związki zawierające azot, lub mieszaniny
związków organicznych z substancjami zawierającymi azot.
Wykorzystuje się reakcję:
14
N(n,p)14C
Ze względu na duży ciężar, nie wszystkie atomu 14C opuszczają cząsteczkę.
Przy znakowaniu siarką stosuje się reakcję:
35
Cl(n,p)35S
Przy znakowaniu fluorowcami , korzysta się z reakcji:
M
X(n, γ)M+1X
Atomy odrzutu fluorowców podstawiają atomy wodoru lub grupy atomów w
związkach organicznych. Tak otrzymuje się związki znakowane 38C, 82Br, 128I.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.
Zalety metody
Możliwość otrzymania związku w jednym etapie. Odpada wiele żmudnych,
wieloetapowych syntez.
•
•
•
•
Uniwersalność metody.
Możliwość otrzymania związków beznośnikowych.
W jednym procesie można otrzymać dużą ilość związku.
Z dobrą wydajnością otrzymuje się związki znakowane izotopami
krótkożyciowymi.
Wady
• Nie można otrzymać związków specyficznie znakowanych.
• Trudności w wydzieleniu i oczyszczeniu znakowanych związków.
• Synteza musi być prowadzona w silnym strumieniu neutronów (kanał
reaktora
Synteza związków znakowanych 14C
Substratem do tej syntezy jest Ba14CO3, który otrzymuje się w reaktorze w wyniku
napromieniowania azotku berylu. Wykorzystuje się reakcję jądrową:
14
N(n, p)14C
Z Ba14CO3 otrzymuje się pięć podstawowych związków będących substratami do
dalszej syntezy. Są to:
14
CO2;
14
K14CN;
NH214CN (cyjanoamid);
C2 H2 ;
14
CH3OH
CO2 otrzymuje się przez rozkład Ba14CO3:
14
Ba CO3
14
14
HClO4
lub H2SO4
14
CO2
C-cyjanoamid otrzymuje się działając amoniakiem na Ba14CO3 w temp. 850oC:
14
Ba CO3
NH3
850 oC
14
NH2 CN
Synteza związków znakowanych 14C c. d.
14
C-acetylen otrzymuje się przez redukcję Ba14CO3 magnezem i rozkład
wodą powstałego 14C-węglika baru:
14
Ba CO3
14
Mg
∆
14
Ba C2
H2O
14
C2H2
C-metanol otrzymuje się przez redukcję 14CO2 przy pomocy LiAlH4:
14
CO2
LiAlH4
14
CH3OH
Synteza 14C-alkanów
Synteza 14C-metanu
14
14
CO2
H2
kat.
CO2
LiAlH4
14
CH3OH
14
HI
14
CH4
CH3I
Mg
14
CH3MgI
+
14
H
CH4
Synteza [1,2-14C2]-propanu
14
+2
C2H2
Cr , H
+
14
RT
14
C2H4
14
CH3 CH2CH2OH
p-MeC6H4SO3H
14
14
HI
14
LiAlH4
CH3 CH2CH2OTs
C2H5I
14
Mg
14
C2H5MgI
CO2
C2H5COOH
NaBH4
14
14
CH3 CH2CH3
14
[1,2- C2]-propan
Synteza 14C-alkanów
Synteza 14C-metanu
14
14
CO2
H2
kat.
CO2
LiAlH4
14
CH3OH
14
HI
14
CH4
CH3I
Mg
14
CH3MgI
+
14
H
CH4
Synteza [1,2-14C2]-propanu
14
+2
C2H2
Cr , H
+
14
RT
14
C2H4
14
CH3 CH2CH2OH
p-MeC6H4SO3H
14
14
HI
14
LiAlH4
CH3 CH2CH2OTs
C2H5I
14
Mg
14
C2H5MgI
CO2
C2H5COOH
NaBH4
14
14
CH3 CH2CH3
14
[1,2- C2]-propan
Synteza aminokwasów deuterowanych lub trytowanych
w pozycji α
(inkorporacja deuteru lub trytu z rozpuszczalnika)
Do syntezy
A
2
R
C
gdzie A = D lub T
COOH
NH2
korzysta się z dekarboksylacji aminokwas dwukarboksylowego w środowisko HTO i
stężonego HCl lub stężonego DCl (D2O).
1
R C NHCH(COOR )2
+
2
RX
EtOH, abs
O
A
2
R
EtONa
C
2
1
R C NH-CR (COOR )2 + HX
O
1
D2O, DCl
COOH
HTO, HCl
NH2
Powstający carboanion RCONH-C(-)(COOR1)2 w reakcji z R2X daje produkt 1. Deacetylację i
dekarboksylację 1 prowadzi się pod chłodnicą zwrotną ogrzewając 1 w ciągu 4 - 5 h w D2O (lub
HTO) w obecności DCl lub D2SO4 (albo HCl lub H2SO4)
Dekarboksylacji ⊕NH3CR2(COOH)2 w D2O (lub HTO) do końcowego aminokwasu
towarzyszy inkorporacja deuteru (lub trytu) ze środowiska reakcji w pozycję α.
Synteza [2-3H]-L-fenyloalaniny
CH2(COOH)2
COOT
CHT
HTO
O
H
COOH
COOT
T
kwas
3
[2- H]-cynamonowy
T
COOH
NH2
3
[2- H]-L-Phe
+
PAL, NH4
pH 10
Enzymatyczna synteza L-tryptofanu i 5’-hydroksy-Ltryptofanu znakowanego izotopami wodoru w pozycji α
COOH
D/T
COOH
NH2
R
+
NH
(5'-R)-indol
TPase (EC 4.1.99.1)
R
NH2
S
D2O (HTO lub DTO)
S-metyl-L-cysteina
R = -H or -OH
NH
(5'-R)[2-D/ T ]-L-Trp
Synteza [3R-3H]-L-fenyloalaniny
COOH
H
T
NH2
T
(PhCO)2
HTO
KCN
PhCTO
CH2(COOH)2
COOH
PAL
benzil
kwas
3
[3- H]-cynamonowy
3
[3R- H]-Phe
Synteza [3S-3H]-L-fenyloalaniny
COOH
COOH
T
NH2
H
+
PAL, NH4 , HTO
pH 10
3
[2S- H]-L-Phe
Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego
ClCH2COOH
NaOH
14
K CN
ClCH2COONa
14
C OONa
NaOH
14
N CCH2COONa
COONa
HCl
14
COOH
14
C OO
CaCl2
Ca
COOH
COOH
COO
14
COOH
14
H
14
+
[1 - C]cinnamic acid
COOH
O
H
Synteza kwasu [2-14C]-cynamonowego
COOH
O
14
CH
COOH
H
14
CH2
COOH
- CO2
- H2O
14
kwas [2- C]-cynamonowy
Synteza kwasu [3-14C]-cynamonowego
14
MgBr
14
COOMgBr
COOH
14
CO2
1
H3O
+
2
LiAlH4
COOH
COOH
14
C
H2C
14
C
COOH
O
H
14
CH2OH
YADH
pH 8.7
3
5
4
kwas
14 [3- C] cynamonowy
Synteza L-fenyloalaniny i L-tyrozyn znakowanych
14
C w łańcuchu bocznym
COOH
COOH
PAL
pH 10
NH3
14
kwas
14
[1- C]-, [2- C]- lub [3- C]-cynamonowy
14
14
14
[1- C]-, [2- C]- lub [3- C]-L-Phe
14
4'-monooksygenaza-L-fenyloalaninowa
COOH
NH3
HO
14
14
14
[1- C]-, [2- C]- lub [3- C]-L-Tyr
* =
14
C label
pH 6.8
Synteza [1-14C]-L-tryptofanu
i 5’-hydroksy-[1-14C]-L-tryptofanu
14
C OOH
14
COOH
D-AAO/catalase
NH2
GPT
O
14
kwas [1- C]-pirogronowy
14
[1- C]-alanina
14
COOH
R
NH2
R
NH
NH
tryptophanase
14
[1- C]-L-Trp
lub
14
5'-OH-[1- C]-L-Trp
R = H or OH
Metody syntezy aldehydu [1- 14C ]-benzoesowego
14
14
COOH
SOCl2
COCl
HCN
chinolina
NH3
14
CONH2
N
C
CN
14
MeOH
O
14
COOMe
H2O
H2SO4
NaCl, AlCl3
∆T
14
CN
NH2NH2
14
CONHNN2
N
C
14
COOH
OH
PhSO2Cl
pirydyna
HCl
14
CCl=NH
HCl, SnCl2
14
CONHNHSO2Ph
Na2CO3
HOCH2CH2OH
14
CH=NH.HCl
H2O
14
CHO
Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.
14C OOH
14C OCl
SOCl 2
14C OOCH3
CH3OH
NH2NH2
14CONHNHSO2Ph
14C HO
14C ONHNH2
C6H5SO2Cl
Na2CO3
(CH2OH) 2
C5H5N
14COCl
14CONH2
NH3
NaCl . AlCl
14CN
3
ogrzewanie
HCl
14C HO
14CH
H2O
NH . HCl
14CCl
SnCl2
HCl
NH
Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.
+
14COCl
HCN
chinolina
H
N
H2O
H2SO4
N
CN
CN
HO14C HC6H5
14COC6H5
14CHO
+
N
COOH
Otrzymywanie benzaldehydu znakowanego równomiernie atomami 14C
CH3
Ce(SO4)2
H2SO4
CHO
Rozszczepienie dibenzylu do aldehydu i kwasu benzoesowego
O- O
O O
C
C
C
+ CN -
D
CN
O
C O C
.C.-
D2O
CN
C
CN
O
D
CO2+
C
+ DCN
O
O C
Synteza kwasu [1-14C]-malonowego.
14
Na CN
ClCH2COONa
0 oC
HCl
14
N CCH2COONa
1. NaOH, ∆ Τ
2. CaCl2
14
COOH
COOH
3. HCl
Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego poprzez reakcję Grignard’a
14
BrMg
14
Ba CO3
14
CO2
Et2O
HOO C