T - Wydział Chemii UJ - Uniwersytet Jagielloński

T - Wydział Chemii UJ - Uniwersytet Jagielloński

CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
ZNACZENIE PODSTAWIENIA IZOTOPOWEGO W IDENTYFIKACJI DRGAŃ
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
Woda bowiem bardzo słabo rozprasza na „sposób” ramanowski padające promieniowanie
NORMALNYCH STRUKTUR DEOKSY i ADDUKTÓW CO I O2 HEMOGLOBINY I
elektromagnetyczne, a więc efekt RS jest mały, natomiast silnie absorbuje promieniowanie IR. To
MIOGLOBINY PRZY UŻYCIU REZONANSOWEGO EFEKTU RAMANA
powoduje, iż metoda RS jest metodą o ogromnym znaczeniu w wyznaczaniu struktur oscylacyjnych
związków i układów biologicznych in vitro i in vivo. Niestety, wspomniana już wcześniej, niska czułość
Edyta Podstawka1 i Leonard M. Proniewicz2
1
tej metody (stężenia rzędu 0.1% wag.) często stanowi spore wyzwanie dla eksperymentatora.
Środowiskowe Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych Uniwersytet
Jagielloński, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków; e-mail: [email protected]
2
Ten słaby efekt Ramana może jednak zostać wzmocniony o rząd 103-106 jeśli długość linii
wzbudzającego promieniowania elektromagnetycznego znajduje się w pobliżu lub pokrywa się z
Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków;
maksimum pasma absorpcyjnego wzbudzenia elektronowego badanej molekuły.
e-mail: [email protected]
Rozważając rozproszenie ramanowskie na pojedynczej cząsteczce, wyrażone poprzez liczbę
fotonów rozproszonych w przeciągu sekundy, otrzymuje się intensywność promieniowania rozproszonego
Ifi związanego z przejściem z początkowego stanu oscylacyjnego i〉 do stanu oscylacyjnego f〉 wyrażoną
1. Mechanizm rezonansowego efektu Ramana
wzorem1-3:
Nieelastyczne rozproszenie promieniowania elektromagnetycznego na molekułach zostało odkryte
w roku 1928 przez Chendrasekharę Vankatę Ramana i od tej pory nazywane jest rozproszeniem
π2
Ifi(π/2) = ε02 (ν0 - νfi) ν0 g0 Σ [αρσ]fi [αρσ]fi*
[1]
ρσ
(normalnym) Ramana, RS (ang. Raman scattering). Za swe odkrycie Raman otrzymał w 1930 roku
nagrodę Nobla z fizyki. Efekt ten pozwala na obserwowanie przejść w molekułach na poziomach
gdzie: ε0 określa przenikalność elektryczną w próżni, ν0 i I0 – częstość i natężenie wzbudzającego
promieniowania elektromagnetycznego, ν0 - νfi – częstość promieniowania rozproszonego, która liniowo
rotacyjnych i oscylacyjnych (możliwość rejestracji widm oscylacyjno-rotacyjnych).
Rozproszenie typu RS jest słabym efektem; jedynie około 10-6 fotonów padającego
promieniowania po oddziaływaniu z materią jest rozpraszana nieelastycznie. A więc, w otrzymanym
widmie pojawiają się fotony o energiach większych lub mniejszych niż te, które zostały użyte do
zależy od I0, a [αρσ] fi jest ρσ-tą składową tensora polaryzowalności. Sumowanie odbywa się po nie
zerowych składowych polaryzowalności.
Składowe tensora polaryzowalności można opisać równaniem dyspersyjnym KramersaHeisenberga, które przyjmuje postać1-3:
wzbudzenia próbki.
Z powodu słabej intensywności sygnału (wzbudzenia) spektroskopia ta, będąca spektroskopią
komplementarną do spektroskopii absorpcyjnej w podczerwieni, IR (ang. infrared), jest spektroskopią
[αρσ]fi =
1
hc
Σ
{
rr≠i
≠i,f f
}
[µρ]fr[µσ]ri
+ [µσ]fr [µρ]ri
νri - ν0 - iΓr νrf + ν0 + iΓr
[2]
eksperymentalnie trudniejszą i bardziej kosztowną niż IR, jakkolwiek ogromny postęp techniki zaczyna
powoli zacierać te różnice. Bez względu na „nowinki” techniczne, RS jest metodą znakomicie nadającą
i jest wyprowadzone z czasowo zależnej teorii zaburzeń. W równaniu tym wyrażenie [µρ]fr odpowiada ρ-
się do badania wszelkich substancji obecnych w roztworach wodnych w przeciwieństwie do metody IR.
tej składowej momentu dipolowego przejścia dla przejść oscylacyjnych f〉 ←r〉, iΓ jest tzw. członem
33
34
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
tłumienia, który jest odwrotnie proporcjonalny do czasu życia stanu r〉 i jest miarą szerokości pasma dla
których można zastosować przybliżenie ABO zależność ta może zostać wyrażona równaniem Herzberga-
przejścia elektronowego. Sumowanie odbywa się po wszystkich stanach molekuły, włączając i〉 i f〉. Te
Tellera (HT).
dwa stany mogą być pominięte przy sumowaniu w opisie rozproszenia Ramana.
Jak wynika z powyższego równania, wartość pierwszego członu równania rośnie, gdy częstość
wzbudzającego promieniowania elektromagnetycznego ν0 zbliża się do częstości przejścia elektronowego
νri (jakkolwiek nigdy nie zmierza do nieskończoności dzięki obecności członu tłumienia iΓ, w
[µρ]ge = [µρ]ge0 + Σ
s
Σ [µρ]gs0
k
hsek
νe - νs Qk + …;
δH
e〉
δQk Qk=0
hsek = 〈s
[4]
gdzie: s〉 reprezentuje dodatkowy wzbudzony stan elektronowy. Rozważanie pierwszego członu tego
równania (zerowego rzędu) prowadzi do przybliżenia Condona. Z członu pierwszego rzędu wynika, iż
przeciwnym bowiem razie mianownik osiągnąłby wartość równą zero), co prowadzi do znacznego
zmiany Hamiltonianu H względem współrzędnych normalnych Qk mogą prowadzić do mieszania się
wzmocnienia jednej lub kilu składowych polaryzowalności, a zatem i wzmocnienia sygnału Ramana.
stanu elektronowego e〉 z innym stanem s〉 o odpowiedniej symetrii. Natomiast człony wyższego rzędu
Mechanizm ten odpowiedzialny jest za tzw. rezonansowy efekt Ramana, RR.
tego rozwinięcia zazwyczaj nie są rozważane.
Przy wzbudzeniu rezonansowym wkład od drugiego członu polaryzowalności, który jest
Powyższe równanie HT nie stosuje się, gdy nie jest spełniona zależność ABO, jak ma to miejsce w
nierezonansowy, maleje i często jest zaniedbywany. Otrzymane tak równanie charakteryzuje zależność
przypadku silnego sprzężenia wibronowego. Może się to zdarzyć w sytuacji, gdy separacja energii
rezonansowego rozproszenia Ramana względem wzbudzonych stanów elektronowych cząsteczki, a w
pomiędzy stanami e〉 i s〉 jest bardzo mała lub nawet równa zero. Ten ostatni przypadek występuje w
szczególności ich geometrii. W rozważaniach kwantowo-mechanicznych przejść oscylacyjnych w
molekułach stosuje się przybliżenie adiabatyczne Borna-Oppenheimera (ABO),4 które polega na
oddzieleniu funkcji falowej elektronowej od funkcji falowej oscylacyjnej i na wprowadzeniu formalizmu
Herzberga-Tellera5 w celu zanalizowania zależności funkcji falowych elektronowych od odległości
między jądrami. Rozdzielenie stanów elektronowych i oscylacyjnych (ABO) pozwala zapisać moment
przejścia w postaci 〈n[µρ]geν〉 przy założeniu, że operator momentu dipolowego nie działa na
oscylacyjne funkcje falowe. Polaryzowalność takiego przejścia można zatem opisać jako :
1
hc
Σ
eν
〈n[µρ]geν〉 〈ν[µσ]egm〉
νeν,gm - ν0 - iΓr
W pewnych wypadkach może pojawić się sprzężenie wibronowe pomiędzy stanem podstawowym
i stanami wzbudzonymi. Ten efekt, który jest efektem rzadko spotykanym można opisać następującym
równaniem:
k
[µρ]ge = [µρ]ge0 + Σ
Σ [µρ]se0 νhs gs- νg Qk + …;
s
1
[αρσ]gn,gm =
przypadku stanów zdegenerowanych, dla których pojawia się sprzężenie Jahna-Tellera (JT).
[3]
k
hgsk = 〈g
δH
s〉
δQk Qk=0
[5]
Podstawiając człony zerowego i pierwszego rzędu w rozwinięciu HT do momentów przejścia
〈n[µρ]geν〉 i 〈ν[µσ]egm〉 otrzymuje się:
gdzie: [µρ]ge jest ρ-tą składową dipolowego momentu przejść elektronowych g〉←e〉 (g〉 - stan
〈n[µρ]geν〉 = [µρ]ge0 〈nν〉 + 1 Σ
hc
podstawowy i e〉 - stan wzbudzony elektronowy), a m〉, n〉 i ν〉 opisują stany oscylacyjne. Moment
〈ν[µσ]egm〉 = [µσ]eg0 〈νm〉 + 1 Σ
hc
przejścia elektronowego zależy parametrycznie od współrzędnych oscylacyjnych Qk i w warunkach, w
35
s
s
Σ [µρ]gs0
k
hsek 〈nQkν〉 + 1 Σ Σ [µρ]se0 hgs 〈nQkν〉
∆νsg
hc s k
∆νes
[6]
k
k
0 hse
0 hgsk
1
Σ [µσ]sg
〈νQkm〉 +
Σ Σ [µσ]se
〈νQkm〉
∆νes
hc s k
∆νsg
k
36
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
Równanie to można uprościć rozdzielając zgodnie z ABO elektronowe i oscylacyjne funkcje falowe wraz
jest mała w porównaniu z różnicą energii pomiędzy przejściami elektronowymi, wielkość νeν,gm - ν0 - iΓeν
z następującym po nim rozwinięciem HT funkcji falowych elektronowych, przy założeniu, iż przesunięcia
dla różnych νeν odgrywa rolę jedynie niewielkiego czynnika wagowego. Wielkość ta wraz z
jąder są opisywane za pomocą współrzędnych normalnych.
6,7
Otrzymuje się wtedy cztery składowe tego
równania:
elektronowym udziałem opisanym poprzez dipolowy moment przejścia, 〈n[µρ]geν〉, określa całkowite
wzmocnienie wszystkich drgań oscylacyjnych dla danego przejścia elektronowego przy określonej
[αρσ]gn,gm = [αρσ]gn,gmA + [αρσ]gn,gmB +[αρσ]gn,gmC +[αρσ]gn,gmD
[7]
częstości wzbudzającego promieniowania elektromagnetycznego. Wkład od oscylacyjnych funkcji
falowych jest opisany poprzez nakładanie się całek Francka-Condona 〈ngνe〉 i 〈νemg〉 dla członów A, B i
gdzie:
C i całek zależnych od współrzędnej normalnej 〈ngQkνe〉 i 〈νeQkmg〉 dla członów B, C i D. Całki te
[αρσ]gn,gmA
〈ngνe〉 〈νemg〉
νeν,gm - ν0 - iΓeν
Σ
1
= hc [µρ]ge0 [µσ]eg0
ν
[8]
korelują symetrię drgań z ich aktywnością ramanowską i stanowią podstawę reguł wyboru dla
rozproszenia Ramana.
hsek
1
[αρσ]gn,gmB = h2c2 [µρ]ge0 [µσ]sg0 ∆ν
es
Σν
hesk
1
0
0
+ 2 2 [µρ]ge [µσ]sg
∆νse
hc
Σ
ν
Dla w pełni dozwolonych przejść, które wykazują dużą wartość 〈n[µρ]geν〉, mechanizm
〈ngQkνe〉 〈νemg〉
νeν,gm - ν0 - iΓeν
〈ngνe〉 〈νeQkmg〉
νeν,gm - ν0 - iΓeν
[9]
rezonansowego wzmocnienia pochodzi od członu A, który opisuje oddziaływanie oscylacyjne z
pojedynczym wzbudzonym stanem elektronowym. Elementy macierzowe hk/∆ν opisują zależność energii
stanu e〉 od współrzędnej oscylacyjnej, która jest opisana przez całki nakładania Franka-Condona.9,10
[αρσ]gn,gmC
+
1
= h2c2 [µρ]se0 [µσ]eg0
hsgk
∆νgs
hgsk
1
[µρ]ge0 [µσ]es0 ∆ν
sg
hc
2 2
hsek
1
[αρσ]gn,gmD = h3c3 [µρ]gs0 [µσ]eg0 ∆ν
se
Σ
ν
hesk
∆νse
Σ
ν
Tylko dla drgań w pełni symetrycznych całki nakładania są niezerowe dla początkowego i końcowego
〈ngQkνe〉 〈νemg〉
νeν,gm - ν0 - iΓeν
〈ngνe〉 〈νeQkmg〉
νeν,gm - ν0 - iΓeν
stanu rozpraszającej molekuły. Dlatego też, rezonansowe wzmocnienie opisane przez człon A określa
[10]
wzmocnienie tych drgań (symetria drgań A1g dla molekuły o symetrii punktowej D4h).11 Inaczej, człon A
wzmacnia oscylacje, w czasie których przesunięcia jąder atomowych zachodzą wzdłuż współrzędnych
e〉 〈νeQkmg〉
Σ 〈ngQνeνkν
,gm - ν0 - iΓeν
molekularnych, które są różne dla stanów podstawowego i wzbudzonego. Na przykład w hemoproteidach,
[11]
jeśli długość wiązania pomiędzy ligandem aksjalnym i jonem żelaza zmienia się pomiędzy stanem
ν
podstawowym i wzbudzonym, wzmocnienie drgania rozciągającego Fe(II)-ligand następuje poprzez człon
Równanie [7] opisuje cztery mechanizmy rezonansowe, które odpowiadają warunkom, gdy e = f
oraz e ≠ f. W równaniu tym czynnik tłumiący jest pominięty, a odpowiednie wyrazy sumy zostały
nazwane przez Albrechta i Hutleya członami A, B, C i D.8
A. Ogólnie biorąc człon A odpowiedzialny jest za wzmocnienie rezonansowe drgań pierścienia hemu przy
wzbudzeniu w zakresie pasma Soret.12 Zdarzają się przypadki, w których człon A opisuje mechanizm
wzmocnienia drgań nie w pełni symetrycznych, jednakże nie będzie to dyskutowane w tym opracowaniu.
Każdy z czterech powyższych członów zawiera wkład od elektronowych i oscylacyjnych funkcji
falowych i energii stanów wzbudzonych. Ponieważ różnica energii pomiędzy poziomami oscylacyjnymi
37
Człon B opisuje wibronowe sprzężenie stanu elektronowego z jednym lub kilkoma innymi
elektronowymi stanami wzbudzonymi. Drganie aktywne może mieć dowolną symetrię, która jest zawarta
38
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
w iloczynie prostym dwóch reprezentacji przejścia elektronowego. Człon ten opisuje wzmocnienie
tak, co przedstawiono na rysunku 2, pomiar przy użyciu linii z zakresu 180-200 nm pozwala uzyskać
drgania hemoproteidów przy wzbudzeniu w zakresie α i β pasm absorpcyjnych, przy czym wzmacniane
informacje wyłącznie na temat drgań wiązań peptydowych szkieletu polipeptydowego białka.14,15
są głównie drgania niesymetryczne (symetria A2g, B1g i B2g). Wynika to ze znaczącego wkładu absorpcji w
KONTROLER
zakresie pasm α i β, która pochodzi od oscylacyjnego „pożyczania” intensywności z pasma Soret. W
sytuacji, gdy rezonansowe przejście elektronowe jest tylko częściowo dozwolone i 〈n[µρ]geν〉 <
PC
Rysunek. 1 Schemat ideowy
systemu
pomiarowego
stosowanego w spektroskopii
zarówno normalnego, jak i
rezonansowego efektu Ramana (P
- pryzmat, CL i FL – soczewki,
NF – filtr Notach i SC –
skrambler).
CCD
WIRUJĄCA KAPILARA
FL
〈ν[µσ]egm〉 wkład członu C do wzmocnienia jest dominujący. Ponieważ człon C opisuje sprzężenie
SPEKTROMETR
P
CL
wibronowe stanu elektronowego podstawowego z jednym lub kilkoma stanami wzbudzonymi człon ten
NF
SC
jest więc dominującym, gdy słabe przejście elektronowe jest wibronowo sprzężone z drugim o znacznie
+
większej intensywności, jak w przypadku metaloporfiryn. Drgania aktywne opisane przez człon C mogą
+
Kr , Ar lub He-Cd LASER
P
wykazywać dowolną symetrię zgodną z teorią grup, a będącą wynikiem iloczynu dwóch stanów
elektronowych.13 Człon D opisuje sprzężenie wibronowe pomiędzy stanem wzbudzonym i jednym lub
W badaniach strukturalnych hemoproteidów niezwykle ważnym zagadnieniem jest dobór linii
kilkoma stanami wzbudzonymi (sprzężenie obu elektronowych momentów przejść), których funkcje
promieniowania wzbudzającego, które umożliwia selektywne badanie poszczególnych ich fragmentów. I
falowe zależą od współrzędnych normalnych. W konsekwencji, tylko nadtony są wzmacniane przez człon
tak, co przedstawiono na
D. Wkład do wzmocnienia od członu D jest znaczący, gdy 〈ν[µσ]egm〉 ≥ 〈n[µρ]geν〉.
rysunku 2, pomiar przy
Phe
Trp
2. Aparatura pomiarowa
pasmo Soret (B lub γ)
π→π*, ε ~105-106
M/cm
użyciu linii z zakresu 180200 nm pozwala uzyskać
Jak wspomniano uprzednio, rozproszenie ramanowskie jest stosunkowo słabym efektem, dlatego
His
absorpcja
informacje wyłącznie na
pasma Q, ε ~104 M/cm
β (π→π*) i α (sprzeżenie
wibronowe)
Thr
też obserwacja tego efektu wymaga stosowania intensywnego promieniowania monochromatycznego i
czułych detektorów. Nowoczesna aparatura pomiarowa używana w spektroskopii rezonansowego efektu
Ramana składa się z trzech podstawowych elementów: lasera, jako źródła wzbudzającego promieniowania
monochromatycznego, spektrometru mającego na celu analizę częstości promieniowania rozproszonego
na próbce i detektora. Schemat takiego systemu przedstawiono na rysunku 1.
temat
drgań
peptydowych
200
300
400
500
600
wiązań
szkieletu
700
długość fali (nm)
Rysunek 2. Widmo elektronowe natywnej hemoglobiny w formie adduktu z
monotlenkiem węgla(II).
polipeptydowego
białka.14,15 Wzbudzenie w
zakresie 200-240 nm wzmacnia wyłącznie pasma Ramana pochodzące od aminokwasów aromatycznych
W badaniach strukturalnych hemoproteidów niezwykle ważnym zagadnieniem jest dobór linii
promieniowania wzbudzającego, które umożliwia selektywne badanie poszczególnych ich fragmentów. I
39
bocznych łańcuchów białka (widma UV-RR),16,17 podczas gdy wzbudzenie w zakresie światła
widzialnego dostarcza informacji wyłącznie o strukturze hemu(ów) (widma RR lub VIS-RR)18-20.
40
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
O2, ν(Fe-O2), czy Fe-CO, ν(Fe-CO), drgania zginające Fe-O2, δ(Fe-O-O), czy Fe-CO, δ(Fe-C-O), czy też
3. Hem - symetria drgań
Najczęściej spotykaną grupą prostetyczną hemoproteidów jest hem b, nazywany również
drgania rozciągające O-O, ν(O-O), czy C≡O, ν(C≡O).
"protohemem" lub ferroprotoporfiną IΧ. Występuje on w hemoglobinie (Hb), mioglobinie (Mb),
peroksydazach, katalazach, czy cytochromie P450.21 Jest to układ makrocykliczny, w którym cztery
4. Podstawienia izotopowe hemu
pierścienie pirolowe połączone są mostkami metinowymi tworząc układ sprzężonych wiązań podwójnych
Podstawienie w cząsteczce atomu jego izotopem, np. protonu deuteronem, powoduje zmianę
nadających hemowi intensywny kolor czerwony. W hemie b przy atomach Cβ pierścieni pirolowych
częstości drgania ν w wyniku zmiany masy (mred), podczas gdy stała siłowa tego drgania f nie ulega
występują trzy różne podstawniki: cztery grupy metylowe (w pozycjach 2, 7,12 i 18), dwie grupy
zmianie. Zależność częstości drgania (w cm-1) od stałej siłowej (N/m) i masy zredukowanej oscylatora
winylowe (w pozycjach 3 i 8) i dwie grupy propionowe (w pozycjach 13 i 17), jak przedstawiono to na
harmonicznego wyraża się wzorem:
rysunku 3. Jon metalu skoordynowany centralnie z czterema atomami azotu pierścieni pirolowych stanowi
1
ν = 2πc
nierozerwalną część tak powstałego układu sprzężonych wiązań podwójnych. Stąd też każda zmiana
√m
f
[12]
red
struktury hemu wpływa na gęstość elektronową jonu żelaza analizie vice versa.
s Przy analizie widm RR hemów zakłada się model, w
12
8
Cβ
Cα
którym podstawniki traktuje się jako masy punktowe oraz
7
3
13
stąd dla drgania izolowanego łatwo jest przewidzieć częstość odpowiedniego drgania normalnego po
podstawieniu izotopowym.
przyjmuje się, iż wszystkie atomy łącznie z jonem metalu znajdują
Badania metodą RR związków modelowych hemu, jak np. niklowych kompleksów
(Ni(II)(OEP)),23-26
etioporfiryny-I
(Ni(II)(ETP-I)),27
się w jednej płaszczyźnie. Tak zdefiniowany model ma symetrię
oktaetyloporfiryny
1,5-dihydroksy-1,5-
punktową D4h.22 Zgodnie z teorią grup, w widmach RR
dimetyloktaetylobakteriochloryny ((Ni(II)(HOEBC)))28 i ich deuterowanych pochodnych, a także
spodziewanych jest więc 71 drgań w płaszczyźnie (9A1g + 8A2g +
porfiryny bez jonu metalu29 pozwoliły na zaproponowanie przypisania pasm odpowiednim oscylacjom
9B1g + 9B2g + 18Eu) oraz 34 drgania poza płaszczyznę (3A1u + 6A2u
hemów, które pojawiają się w widmach hemoproteidów. Analiza widm RR grup prostetycznych
+ 4B2u + 5B1u + 8Eg). Do grupy drgań aktywnych w RR należy: 35 drgań w płaszczyźnie (9
mioglobiny20,30 i cytochromu c31 została zaproponowana w oparciu o specyficznie deuterowane hemy.
spolaryzowanych (A1g), 18 zdepolaryzowanych (B1g i B2g) i 8 drgań wykazujących anomalną polaryzację
Podstawienia izotopowe hemu typu: 14N/15N, 1H/2H (d4 - podstawienie deuterem protonów w pozycji meso
(A2g)) oraz 8 drgań poza płaszczyznę (Eg). Drgania o ymetrii Eu i A2u są drganiami aktywnymi w
pierścienia hemu, d6(2,7), d6(12,18) i d12 (podstawienie grup metylowych hemu, odpowiednio, w pozycjach
podczerwieni, jakkolwiek w wyniku obniżenia symetrii tego układu np. do C2v (poprzez różne
2 i 7, 12 i 18 oraz 2, 7, 12 i 18), czy d16 (podstawienie protonów meso i grup metylowych hemu), 54Fe/57Fe i
podstawniki w pierścieniu hemu) drgania Eu stają się drganiami aktywnymi w RR.
32
Cm
Cd
18 2
Cc
17
Rysunek 3. Struktura i schemat
oznaczania atomów w protohemie.
Dodatkowo, w widmach RR pojawiają się drgania grup metylowych, winylowych i
propionowych, a także drgania Fe-ligand aksjalny np.: Fe-histydyna, ν(Fe-His), drgania rozciągające Fe-
41
S/34S w Mb,30 cytochromie c,28,32 cytochromie c peroksydacyjnym33 i cytochromie P45034 lub Hb i jej
izolowanych podjednostkach oraz hybrydach18-20,28,30,35,36 umożliwiły w miarę poprawne i logiczne
przypisanie tych pasm RR odpowiednim drganiom. Ponadto, podstawienie izotopowe, np.
16
O2/18O2 i
42
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
12
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CO/13CO (ligandy aksjalne) pozwoliły na zdefiniowanie częstości grup molekularnych Fe-O2 i Fe-CO, a
tym samym struktury wiązania tych diatomowych molekuł do jonu żelaza.
W związku deoksy jon żelaza(II) jest
δ(C 13,17CcCd) ν33 i γ21
ν(Fe-His)
γ7
ν
ν9 52 ν8 δ( αCβ)
γ21 ν48
37-40
wysunięty poza średnią płaszczyznę hemu o
0.5
5. Podstawienia izotopowe w badaniach wybranych hemoproteidów przy użyciu rezonansowego
natywna
efektu Ramana
15
Jak już wspomniano, w widmach RR hemoproteidów obserwuje się nie tylko drgania
N
–
0.8
w
zależności
od
hemoproteidu,40,44-50 co wymusza deformację
pierścienia
d6(2,7)
Å
makrocyklicznego
(ang.
„doming” lub „rufling”), a tym samym
rozciągające, czy deformacyjne w płaszczyźnie i poza płaszczyznę pierścienia hemu, ale także oscylacje
grup peryferyjnych (grup winylowych, propionowych i metylowych) i ugrupowania jon żelaza-ligand
aksjalny.30,41 Zatem, dla adduktów z CO i O2 można obserwować drgania: ν(Fe-CO), δ(FeCO) i ν(C≡O),
czy ν(Fe-OO), δ(FeOO) i ν(O-O). Szczególne znaczenie ma również drganie rozciągające wiązania
pomiędzy jonem żelaza(II) hemu, a imidazolem proksymalnej reszty histydyny, ν(Fe(II)-His), które ku
d6(12,18)
powoduje obniżenie symetrii hemu. Zgodnie
d12
więc z teorią grup, wiele spośród drgań,
d4
które ze względów symetrii nie były
d16
rezonansowo aktywne, mogą pojawić się w
widmie RR.
zaskoczeniu jest rezonansowo wzbudzone jedynie w widmach RR pentakoordynacyjnych hemów
-1
przesunięcie ramanowskie (cm )
(związek deoksy) z wysoko-spinowym jonem żelaza. Interpretacja tych złożonych widm byłaby
niemożliwa bez udziału odpowiednio zaprojektowanych podstawień izotopowych. Wystarczy tutaj
Rysunek 4. Widma RR deoksy natywnej hemoglobiny i jej
15
N, d6(2,7), d6(12,18), d12, d4 i d16 podstawionych
izotopowo analogów.
jedynie wspomnieć, iż np. obwiednia („koperta”) pasma złożonego obserwowanego w zakresie 390 – 450
cm-1 w widmie RR adduktu O2 hybryd hemoglobiny zawiera aż 8 pasm pochodzących od tzw. drgań grup
W zakresie niskoczęstościowym widm
winylowych oraz drganie δ(Fe-O-O),42 co będzie szerzej omawiane w dalszej części tej pracy. Stąd też
RR hemoproteidów, w których wysoko-spinowy
staje się jasne, dlaczego analiza drgań hemoproteidów musi być dokonana w oparciu o podstawienie
jon żelaza(II) hemu ma liczbę koordynacyjną
izotopowe. W przeciwnym bowiem wypadku, łatwo jest o błędną analizę otrzymanych widm RR.43
Należy wspomnieć, iż pomimo intensywnych badań nie dokonano pełnej i jednoznacznej analizy drgań
pięć,
pojawia
się
jedno
z
najbardziej
charakterystycznych pasm, które związane jest z
hemów.
drganiem
rozciągającym
wiązania
Fe-Nε
5.1. Drganie jon żelaza-ligand aksjalny
(HisF8), ν(Fe-His). Drganie to obserwuje się
5.1.1. ν(Fe-His)
przesunięcie ramanowskie (cm-1)
wyraźnie przy niższej częstości, 215 cm-1 vs 220 cm1
43
w deoksyHb w porównaniu do deoksyMb, co
Rysunek 5. Widma RR deoksy natywnej mioglobiny i jej
d6(2,7), d6(12,18), d12 i d4 podstawionych izotopowo
analogów [P. Mak, E. Podstawka, J. R. Kincaid, L. M.
Proniewicz „Effects of systematic peripheral group
deuteration on the low-frequency resonance Raman spectra of
myoglobin derivatives”, Biopolymers, 75 (2004) 217, za
pozwoleniem Biopolymers].
44
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
widać na rysunkach 4 i 5. Natomiast w widmach RR izolowanych α i β podjednostek hemoglobiny pasmo
cm-1.53,54 Przykładowo, wpływ podstawienia izotopowego cząsteczki CO na widmo RR mioglobiny
to występuje, odpowiednio, przy 218 i 223 cm-1. Częstość tego drgania jest niezależna od podstawień
adduktu monotlenku węgla(II) prezentuje rysunek 6.
Częstości tych drgań obserwowane w widmach RR i/lub IR różnorodnych hemoproteidów i ich
izotopowych hemu w podstawnikach peryferyjnych pierścienia makrocyklicznego, natomiast jest czuła na
izotopowe podstawienie jonu żelaza.18,51
związków modelowych wraz z obserwowanym przesunięciem izotopowym 12C16O/12C18O przedstawiono
5.1.2. ν(Fe-CO), ν(C≡
≡O) i δ(FeCO)
w tabeli 1.
Dla proponowanej liniowej geometrii fragmentu Fe-C-O przewiduje się jedynie dwa drgania
Kerr i Yu55 badali współzależność częstości drgań ν(Fe-C) i ν(C≡O), którą przypisali silnej
aktywne: rozciągające zgodne w fazie (ang. „in-phase”) i w przeciw fazie (ang. „out-of-phase”).
donacji elektronów π z orbitalu antywiążącego CO do wiązania Fe-CO (ang. π-back bonding donation)
„Przekłada się” to na obserwację w widmach RR dwóch drgań rozciągających tego fragmentu: ν(Fe-C) i
(Fe dπ → C≡O π*). Oznacza to, iż wraz ze wzrostem rzędu wiązania Fe-C maleje rząd wiązania C≡O.
ν(C≡O).52 Z kolei, pojawienie się drgania zginającego, δ(Fe-C-O), świadczy o powstaniu molekuły
Zależność tą (rysunek 7) opisali równaniem:
ν(Fe-C) (w cm-1) = 1935 – 0.73 ν(C≡O)
nieliniowej, dla której fragment Fe-C-O tworzy kąt, nawet silnie
rozwarty, bliski 180o. W wielu przypadkach nieobecność drgania
Wartość współczynnika nachylenia prostej równa -0.73 oznacza, iż za przesunięcie częstości
δ(Fe-C-O) w widmie RR hemoproteidów potwierdza fakt, iż
drgania ν(Fe-C) w 73% odpowiada zmiana częstości drgania ν(C≡O) na jednostkę zmian w zwrotnej
cząsteczka CO wiążąc się do jonu żelaza przyjmuje geometrię
donacji. Ponieważ częstość drgania ν(C≡O) jest około czterokrotnie wyższa od częstości drgania ν(Fe-C) i
liniową prostopadłą do płaszczyzny hemu. Zagadnienie, czy
pamiętając, iż stała siłowa wiązania zmienia się z kwadratem częstości jest oczywistym, że zmiany
struktura wiązania Fe-C≡O tworzy kąt (ang. bend), czy jest
wiązania Fe-C są silniej zależne od „π-back bonding donation”.56
molekułą liniową nachyloną do płaszczyzny hemu zostało w
Tabela 1. Obserwowane częstości drgań i przesunięcia izotopowe (cm-1) fragmentu FeCO w addukcie z monotlenkiem węgla(II)
dla żelazoporfiryn i wybranych białek hemowych [zmodyfikowane ze X.-Y.Li, T. G. Spiro, „Is bound carbonyl linear or bent in
heme proteins? Evidence from resonance Raman and infrared spectroscopic data”, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 6024, za
pozwoleniem American Chemical Society].
sposób bardzo elegancki rozwiązane przez Ghosh i Bociana52,
którzy pokazali, iż Fe-C≡O tworzy obie te struktury, które
Rysunek
6.
Wpływ
podstawienia
izotopowego cząsteczki CO na widmo RR
mioglobiny [M. Tsubaki, R. B. Srivastava,
N.-T. Yu, „Resonance Raman investigation
of carbon monoxide bonding in (carbon
monoxy)hemoglobin
and
-myoglobin:
detection
of
iron-carbon
monoxide
stretching and iron-carbon-oxygen bending
vibrations and influence of the quaternary
structure change”, Biochemistry, 21 (1982)
1132, za pozwoleniem American Chemical
Society].
szybko przechodzą jedna w drugą.
Drgania ν(Fe-C), ν(C≡O) i δ(Fe-C-O) przypisano w
oparciu o podstawienia izotopowe z użyciem
12
12
16
C O,
13
16
C O,
C18O i 13C18O, jakkolwiek jeszcze kilka lat temu proponowano,
iż częstość około 580 cm-1 nie jest częstością drgania
zginającego, lecz nadtonem tego drgania występującego przy 289
45
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
molekuła / rozpuszczalnik
FeOEP / Bz
FeTPP / Bz
FeDeut(THF) / THF
FeTSMP(T2O), pH 7
FeTPivP(THF) / THF
cytochrom c oksydacyjny
FeSP-13(Nmelm) / MC
Mb ze słonia, pH 8.2
FeSP-14(Nmelm) / MC
FePiv2C 2(Nmelm) / Bz
Mb ze spermy wieloryba, pH 8.4
FeSP-15(Nmelm) / MC
Mb z kaszalota, pH 7.0
FePiv2Cx(NMelm) / Bz
ludzka Hb A
FePiv2C10(NMelm) / Bz
12
ν(FeCO) ∆ C
531
5
524
5
530
527
526
5
520
4
514
4
515
3
512
4
515
5
512
3
509
6
507
3
506
5
507
4
497
3
∆18O
10
{14}
{13}
10
6
5
8
9
ν(CO)
1975
1973
1962
1957
1957
1964
1932
1937
1939
1984
1944
1945
1947
1948
1951
1952
∆12C
∆18O δ(FeCO) ∆12C
n.re.
{90}
46
44
{91}
45
44
48
44
44
43
42
48
43
n.re.
n.re.
n.re.
578
579
579
578
576
577
574
575
n.re.
578
n.re.
∆18O
14
11
16
15
21
14
11
16
1
3
1
15
2
46
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
Feα – MedPoc(ImH) / MC
hem-5(NMelm)/MC
PPDME(ImH) / MC
Feα-PocPiv(NMeIm) / MC
FeTPivP(1,2-Me2Im) / Bz
FeAPC(NMelm) / Bz
FePiv2C12(NMelm) / Tol
FeOEP(NMelm) / Bz
zmutowana Mb His(E7)Gly, pH 7
FeTPivP(NMelm) / Bz
Mb z kaszalota, pH 2,6
FeTPP(1,2-Me2lm) / Bz
Hb M Boston-α
FeTSPP(2Melm), pH 7
FeTSMP(4Melm), pH 7
FeTPP(py) / Bz
FeC2-Cap(NMelm) / Bz
Mb zmutowana ze świni His(E7)Val,Val(E11)Thr
Cyt P-450CAM z P. putida + kamfora
FeTPivP(C6HF4S-) / CIBz
Cyt P-450CAM z P. putida (bez substratu)
498
495
495
500
496
491
488
496
492
489
489
494
490
489
486
484
497
479
481
479
464-9
4
4
9
9
4
5
{9}
4
8
4
2
4
4
4
3
5
8
7
9
8
1954
1954
1960
1964
1962
1959
1958
1970
1965
1966-9
1966
1972
1972
1972
1969
1976
2002
1984
1940
1956
1963
45
44
46
567
10
568
9
576
n.re.
{16}
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
4
elektronowej z Fe(II) w kierunku hemu. Stąd też, rząd wiązania Fe-O wynosi około 1.2-1.3, a na ditlenie
pojawia się ładunek ujemny (wytworzenie anionu ponadtlenkowego). Dlatego też, w stosowanym
formalizmie, wiązanie to zapisuje się jako Fe(III)-O2-, a nie Fe(II)-O2, jak było to proponowane przez
Paulina w 1964 roku.58
Podobnie, jak w przypadku nieliniowego fragmentu Fe-C-O, w widmach RR HbO2 i MbO2
n.re.
48
39
43
44
spodziewane są trzy drgania tego fragmentu: ν(Fe-O), ν(O-O) i δ(Fe-O-O). Drganie ν(Fe-O)
48
43
n.re.
n.re.
n.re.
n.re.
43
558
45
n.re.
obserwowane jest w zakresie 567 – 572 cm-1.59-62 Wykazano, iż jego częstość nie ulega zmianie pod
wpływem podstawienia izotopowego hemu,20,36 jakkolwiek jest ono czułe na podstawienie izotopowe
14
3
zarówno cząsteczki tlenu, jak i jonu żelaza. Ostatnio, w widmach RR utlenowanej Hb zlokalizowano przy
około 425 cm-1 drganie δ(Fe-O-O).63 Przypisanie tego pasma było możliwe dopiero w oparciu o widma
różnicowe
16
O/18O izotopowo znaczonych adduktów,63-64 (rysunek 8A) ze względu na jego niską
intensywność i nakładanie się z grupą pasm obecnych w tym zakresie częstości, 400 - 440 cm-1.
Zaskakująco, drganie to nie jest obserwowane w widmach RR mioglobiny (rysunek 8B). Wydaje się, że
Rysunek 7. Współzależność częstości drgań ν(Fe-C) i ν(C≡O) w
widmach RR hemoproteidów (kółka) i związków kompleksowych
(kropki) (numeracja 1-31 zgodna z numeracją zamieszczoną w
Tabeli 1) [X.-Y.Li, T. G. Spiro, „Is bound carbonyl linear or bent in
heme proteins? Evidence from resonance Raman and infrared
spectroscopic data”, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 6024, za
pozwoleniem American Chemical Society].
ν(Fe-C) (cm-1)
różnice w geometrii wiązania Fe-His odpowiedzialne są za rezonansowe wzmocnienie tego drgania.
Niestety, drganie ν(O-O) nie jest rezonansowo wzbudzane w hemach i związkach modelowych, w
których ligandem aksjalnym w pozycji trans do Fe-O2 jest zasada azotowa. Jest to związane
najprawdopodobniej z występowaniem pasma przeniesienia ładunku Fe→O2 w zakresie 780-1200 cm-1.65
Pierwsze doniesienia RR na temat kobaltowej hemoglobiny, w której jony Fe(II) podstawiono jonami
Co(II), wykazały obecność trzech drgań czułych na podstawienie izotopowe cząsteczki ditlenu w zakresie
ν(C≡O) (cm-1)
występowania drgania ν(O-O):66 jednego intensywnego pasma przy 1137 cm-1 i dwóch pasm o niskiej
5.1.3. ν(Fe-OO), ν(Fe-O-O) i δ(FeOO)
intensywności przy 1152 i 1107 cm-1. Pojawienie się tych pasm przypisano występowaniu dwóch
W hemoproteidach tlen molekularny wiąże się do jonu żelaza(II) tworząc addukt, tzw. „liniowy”
konformerów fragmentu Co(II)-O-O. Konformerowi, w którym fragment Co(II)-O-O nie oddziałuje z
(ang. „end-on”), w którym kąt Fe-O-O waha się w granicach 115 – 150o, a wiązanie Fe-O jest
dystalną histydyną przypisano pasmo przy 1152 cm-1. Natomiast, pozostałe dwa pasma określono jako
prostopadłe do płaszczyzny hemu.21 Geometria ta jest zgodna z nakładaniem się orbitali Fe(II) i O2
wynik sprzężenia pomiędzy ν(O-O) drganiem drugiego konformeru (o częstości własnej 1122 cm-1), a
tworzących wiązanie.57 Podczas wiązania się tlenu molekularnego następuje przesunięcie gęstości
drganiem hemu obserwowanym przy 1121 cm-1. Dalsze badania wykazały jednoznacznie, iż obecność w
47
48
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
widmach RR kilku pasm czułych na podstawienie 16O2/18O2 związane jest z występowaniem sprzężenia
5.2. Drgania grup peryferyjnych
oscylacyjnego pomiędzy drganiem ν(O-O) i odpowiednimi drganiami normalnymi zasady azotowej
5.2.1. δ(CCαCβ ) – drgania grup winylowych
znajdującej się w pozycji trans w stosunku do związanej do jonu Co(II) molekuły O2.39,41
A
Szczególne znaczenie odgrywa położenie i ilość pasm pochodzących od drgań grup winylowych.
Wiadomo, że grupy te odgrywają istotną rolę w modulowaniu reaktywności hemoproteidów za pomocą
B
Hb16O2
oddziaływań hem-białko.68,69 Pierwsze dane na temat orientacji grup winylowych względem płaszczyzny
Hb
Mb16O2
hemu i ich oddziaływań z białkiem uzyskano przy wykorzystaniu spektroskopii jądrowego rezonansu
Hb18O2
magnetycznego (NMR).70,71 Jednak dopiero spektroskopia RR dostarczyła wielu ważnych informacji na
α
temat natury grup winylowych w różnorodnych związkach hemowych.51,69,72,73 Badania te wskazują, iż
Mb18O2
α O2
16
pomimo lokalnej symetrii Eu indukowana jest, poprzez obniżenie symetrii, aktywność RR drgań
zginających grup winylowych.43,74 Obserwuje się również charakterystyczne pasma pochodzące od drgań
β
β16O2
rozciągających tych grup (w zakresie powyżej 1600 cm-1).75,76
widmo różnicowe 16O2 – 18O2
meosHb16O2
W widmach RR hemoproteidów mogą pojawić się zatem co najmniej dwa drgania δ(CCαCβ) o
mesoHb
różnych częstościach, co świadczy o zniesieniu degeneracji tych drgań spowodowanej, np. różnym
otoczeniem grup winylowych w „kieszeni” białka lub ich różnym położeniem względem hemu.
widma różnicowe 16O2 – 18O2
Jakkolwiek nasze badania wykazały, iż w „kopercie” pasma złożonego obserwowanego w zakresie 390 –
Rysunek 8. Wpływ podstawienia izotopowego cząsteczki O2 na widma RR A –hemoglobiny i B – mioglobiny [S. Jeyarajah, L.
M. Proniewicz, H. Bronder, J. R. Kincaid, „Low frequency vibrational modes of oxygenated myoglobin, hemoglobins, and
modified derivatives”, J. Biol. Chem., 269 (1994) 31047, za pozwoleniem The American Society for Biochemistry and Molecular
Biology].
450 cm-1 w widmie RR hemoglobiny występuje aż 8 pasm pochodzących od tzw. drgań grup winylowych
odpowiednich łańcuchów.42
Drgania te, co należy podkreślić, nie są izolowanymi drganiami tych grup, lecz zawierają w sobie
16
18
16
16
Widma RR adduktów tlenowych ( O2, O2 i O- O) kobaltowej hemoglobiny oraz jej związków
drgania pierścieni pirolowych, przy których są zlokalizowane. Kitagawa i współ.75 dokonali przypisania
modelowych zaprezentowano i zanalizowano jakościowo w kolejnych opracowaniach.39,40,67 Autorzy tych
tych drgań odpowiednim pasmom w widmach RR używając selektywnie deuterownej w grupach
prac wykazali, iż w CoHbO2 obecny jest tylko jeden ze wspomnianych uprzednio konformerów z
winylowych (3,8–CD=CH2 i 3,8-CH=CD2) niklowej porfiryny Ni(PP) oraz poprzez porównanie z
charakterystycznymi pasmami: ν( O- O) przy 1139 cm , ν( O- O) przy 1106 cm i ν( O- O) przy
prostymi olefinami77. Fakt ten potwierdzają także ostatnie nasze badania Hb i Mb podstawioną
1073 cm-1. Dodatkowo, wykazali oni, że pasma obserwowane w roztworze wodnym przy 1148, 1109 i
mesohemem-IX oraz ich d12 znaczonymi analogami.78
16
16
-1
16
18
-1
18
18
1085 cm-1 pochodzą od drgań histydyny, a nie innego konformeru fragmentu Co(II)-O-O. Albowiem, dwa
-1
Historycznie, już w latach 80-tych drgania grup winylowych zostały przypisane do określonych
pierwsze wspomniane powyżej pasma przesuwają się do 1109 i 1085 cm w wyniku wymiany protonu
pasm w widmach RR wielu hemoglobin, np. monomerycznej erytrokrouryny z Chironomus thumi thumi,51
histydyny w D2O, podczas gdy pasmo 1085 cm-1 ulega przesunięciu aż do 1045 cm-1.
czy tetramerycznej hemoglobiny ludzkiej.79 W swych badaniach Choi i inni43 zaobserwowali w widmie
49
50
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
RR hemoglobiny dwa winylowe drgania deformacyjne δ(CCαCβ) o różnej intensywności przy 422 i 430
zasadową formą pociąga za sobą zmianę konformacji tego białka, która specyficznie zaburza jeden z
cm-1. Zasugerowali więc, że to niewielkie rozszczepienie wskazuje, iż grupy winylowe oscylują
winylowych podstawników. Tym zaburzeniem może być, np. wymuszona zmiana orientacji tego
niezależnie ze zbliżoną częstością. Podobnie, Kalsbeck i inni76 zaobserwowali dwa rozciągające drgania
podstawnika, a tym samym zmiana w rozkładzie energii potencjalnej, PED (ang. potential energy
winylowe, ν(C=C), w widmie RR hemoglobiny przy 1620 i 1631 cm-1. Względne intensywności tych
distribution), drgań normalnych. To, iż drgania δ(CCαCβ) mają inny PED staje się oczywiste przy badaniu
pasm były czułe na zmiany temperatury i pH roztworu wskazując na istnienie dwóch różnych
selektywnie podstawionych hemów w Mb i Hb (np. d4, d6(2,7), d6(12,18), d12, d16 i
konformerów. Okazuje się, że większość hemoproteidów wykazuje zarówno dwa drgania ν(C=C), jak
przedstawionych na rysunkach 9 i 10) lub wspomnianego Ccp,33 dla których to obserwuje się przesunięcia
również dwa δ(CCαCβ),80 co może wskazywać, iż te dwa podstawniki maja różną orientację lub że
izotopowe o różnej wartości w zależności od selektywnego deuterowania. Przypisanie obserwowanych
pojedynczy podstawnik jest na tyle elastyczny w kieszeni białka by zajmować dwie alternatywne
pasm RR w tych widmach odpowiednim drganiom normalnym podaje Tabela 2. Innym wyjaśnieniem
konformacje. Fakt, że dwa drgania winylowe δ(CCαCβ) pojawiają się przy 424 cm-1 w widmie RR Mb, jak
dyskutowanego efektu są zmiany strukturalne hemu, co może modyfikować sprzężenie pomiędzy grupą
również w widmie RR kwaśnej formy oksydazy cytochromowej c (Ccp) nie przeczy hipotezie dotyczącej
różnej orientacji tych podstawników.33
natywna
15
d6(12,18)
d4
d16
Grupy propionowe obecne w pozycjach
Ccp obserwuje się tylko jedno pasmo
13 i 17 pierścienia hemu odpowiadają grupom
pochodzące od drgań grup winylowych,
etylowym w Ni(II)(OEP). Wiedząc, iż grupy
δ(CCαCβ),
alifatyczne wykazują znaczną aktywność RR,
przy
406
cm-1
(drgania
degeneracji
w
tego
wyniku
drgania.
Rysunek 9. Wpływ podstawienia izotopowego N, d6(2,7),
d6(12,18), d12, d4 i d16 na widmo RR hemoglobiny [E.
Podstawka, „Badania struktur molekularnych hemoglobin
metodą rezonansowej spektroskopii Ramana”, Rozprawa
płaszczyznę
δ(CCαCβ) grupy winylowej w pozycji 3
niezmieniona. Z powyższych obserwacji
wynika, że przejście miedzy kwasową i
51
drgania
grup
przypisanie pasm drgań deformacyjnych poza
Drganie
dla grupy winylowej w pozycji 8 pozostaje
iż
widmach RR hemoproteidów. Po raz pierwszy
zniesienia
pierścienia przesuwa się z 406 cm-1 do 418
oczekiwać,
propionowych będą również wzmacniane w
alkalicznej tego enzymu, pasmo to ulega
cm-1, podczas gdy częstość tego drgania
przesunięcie ramanowskie (cm
1
)
należało
zdegenerowane). Natomiast dla formy
-
15
5.2.2. δ(C13,17CcCd) – drgania grup propionowych
Jakkolwiek w widmie RR kwaśnej formy
rozszczepieniu
d12
N analogów
winylową i hemem.33
N
d6(2,7)
15
tych
grup
δ(C13,17CcCd)
zaproponowano dla cytochromu c na podstawie
-1
przesunięcie ramanowskie (cm )
Rysunek 10. Wpływ podstawienia izotopowego d6(2,7),
d6(12,18), d12 i d4 na widmo RR mioglobiny [P. Mak,
E. Podstawka, J. R. Kincaid, L. M. Proniewicz, „Effects
of systematic peripheral group deuteration on the lowfrequency resonance Raman spectra of myoglobin
derivatives”, Biopolymers, 75 (2004) 217, za
pozwoleniem Biopolymers].
niewielkich przesunięć izotopowych i poprzez
analogię
do
drgań
grup
etylowych
w
Ni(II)(OEP).23,24,26 Z kolei Hu i współ.,30 na
podstawie obserwowanego przesunięcia izotopowego
52
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
13,17-(CcH2-CdD2) przypisali pasmo obserwowane przy 370-376 cm-1 w widmach Mb do drgania
Kilka słów komentarza należy również poświęcić drganiom deformacyjnym poza płaszczyznę
δ(C13,17CcCd). W przeciwieństwie do widm RR Mb, w widmach RR Hb przy częstościach około 373 i 385
pierścienia hemu, oznaczanym jako γ, pojawiającym się w widmach RR hemoproteidów. Przypisanie i
cm-1 obserwuje się nie jedno, a dwa pasma związana z drganiami grup propionowych, w których udział
symetria dla kilku z nich zostało przedstawione wcześniej w tabeli 2. Jak udowodniono, efekt deformacji
mają również drgania zginające (ang. tilting) pierścieni pirolowych. Pasmo o wyższej częstości jest
płaskiego hemowego makrocyklu spowodowany jest przesunięciem się jonu żelaza poza płaszczyznę
jednym z najintensywniejszych pasm w niskoczęstościowym zakresie widma dla Hb. Częstość drgania
hemu, co pociąga za sobą zmiany w strukturze hemu, które zostały nazwane jako „doming” lub „rufling”
385 cm-1 ulega przesunięciu o 2-4 cm-1 w stronę niższych częstości pod wpływem podstawienia
w języku angielskim, co odpowiada polskim znaczeniom: daszek lub pofałdowany, a tym samym
izotopowego mostków metinowych (d4) i grup metylowych w pozycjach 2 i 7 hemu (d6(2,7)), podczas
pojawieniem się drgań typu γ. Do tej grupy drgań należą m.in. γ6 i γ7, które pojawiają się w hemach z
-1
gdy częstość pasma 373 cm nie zmienia się. Obserwacja ta wykazuje, iż w tym drganiu pewien udział
wysoko-spinowym jonem żelaza. Inne drgania typu γ mogą pojawić się także w kompleksach z nisko-
18,19
spinowym jonem żelaza. Należy do nich zaliczyć np.: γ5, γ10, γ11, γ16, γ21 i γ22.30 Drgania te są
ma drganie zginające, w którym zaangażowany jest atom węgla mostka metinowego hemu, Cm.
Dodatkowo, oba pasma ulegają znacznym przesunięciom pod wpływem deuterowania grup metylowych
zlokalizowane w widmach RR adduktów O2 i CO praktycznie przy tych samych częstościach. Zmiany
w pozycjach 12 i 18 hemu (d6(12,18)) i w pozycjach czterech grup metylowych (d12) (tabela 2).
częstości tych drgań spowodowane podstawieniami izotopowymi wykazują ten sam trend w
Interpretacja tego zakresu przy pomocy tak izotopowo znaczonych analogów pokazuje, iż grupy metylowe
odpowiednich adduktach (patrz tabela 2).
mają nierównoważny wpływ na drgania grup propionowych.
36
Drganie γ6 (symetria A2u) spodziewane jest w widmach RR wysoko-spinowych kompleksów
hemoproteidów i ich związków modelowych.30 Jak wspomniano powyżej, pojawienie się tego drgania
-1
Tabela 2. Przypisanie niskoczęstościowych pasm hemu oraz obserwowane częstości drgań (w cm ) w widmach RR adduktów CO
izotopowo podstawionych hemoglobin.
drganie
γ23
γ24
ν9
ν52
γ7
γ16
ν8
γ6
ν50
ν51
ν33
γ21
ν25
ν48
sym
Eg
Eg
A1g
Eu
A2u
B2u
A1g
A2u
Eu
Eu
B2g
Eg
A2g
Eu
przypisanie
δ(pyr.tilting)
γ(CαCm)
δ(CβC1)sym
δ(CβC1)sym
γ (CαCm)
ν(Fe-N)
δ(pyr.tilting)
ν(Fe-N)
δ(CβC1)asym
δ(C13,17CcCd)
δ(C13,17CcCd)
δ(CCαCβ)+δ(CN)
δ(CCαCβ)+δ(CN)
δ(pyr.rot.)
ν(Fe-CO)
δ(pyr.fold.)sym
δ(pyr.rot.)
δ(Fe-CO)
δ(pyr.deform.)sym
częstości (cm-1)
15
Hbd16
N-Hb
231
235
242
264
260
272
291
297
308
313
334
340
związane jest z wychyleniem się jonu żelaza poza średnią płaszczyznę porfiryny, co pociąga za sobą
deformację makrocyklu. Pasmo obserwowane w widmach hemoproteidów przy około 347 cm-1 zostało
Hb
231
242
264
272
299
315
343
Hbd4
Hbd12
Hbd6(2,7)
237
237
237
266
294
313
339
266
296
309
336
357
353
357
356
360
351
349
374
386
405
432
480
505
543
558
577
585
373
384
403
432
473
505
537
545
577
363
376
396
421
465
505
362
373
392
421
462
505
374
383
400
430
473
505
365
377
405
432
505
577
577
372
384
405
432
480
505
543
558
577
585
577
585
577
585
270
298
310
Hbd6(12,18)
237
przypisane właśnie temu drganiu. Co ciekawsze, pasmo to zaobserwowano nie tylko dla związku deoksy,
ale także po raz pierwszy, dla oksy podjednostki α i CO podjednostki β przy około 350 cm-1. Było to
297
314
336
możliwe dzięki zastąpieniu protonów w mostkach metinowych (d4) i grupach metylowych hemu (d12)
przez deuterony. To podstawienie spowodowało przesunięcie się pasma γ6 w stronę niższych częstości,
odpowiednio, aż o 21 i 11 cm-1. Znaczną rolę odegrała tutaj precyzyjnie wykonana procedura rozkładu
pasma złożonego na jego składowe (tzw. dekonwolucja).36,42 Sugestia, iż w podjednostkach tych jon
żelaza jest wysunięty poza płaszczyznę hemu została w pełni potwierdzona przez badania
krystalograficzne. Otóż pokazano, iż w oksyHb jon żelaza jest wychylony poza średnią płaszczyznę hemu
o 0.16 Å w podjednostkach α, natomiast leży w płaszczyźnie hemu w podjednostkach β.81 Inaczej
5.3. Drgania poza płaszczyznę hemu
53
54
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
zachowuje się jon żelaza(II) w addukcje CO, w którym w łańcuchach β zostaje wysunięty poza
hybrydach Hb [αN15βN14]2 i [αN14β N15]2 przy 543-556 cm-1.42 Pasmo to wydaje się związane głównie z
płaszczyznę hemu, natomiast nie zmienia swej pozycji w hemie podjednostek α.82
podjednostką α. Fakt ten potwierdzają badania przy użyciu d4 i d12 podstawionych hemów w hybrydach
Relatywnie słabe, poszerzone pasmo z maksimum położonym w zakresie 296-305 cm-1 w
Hb.42 Dlatego, np. w widmie oksyHbd4, która zawiera deuterowany hem we wszystkich czterech
widmach RR hemoproteidów przypisano do drgania γ7 (symetria A2u). Pasmo to pochodzi głównie od
podjednostkach, pasmo 545 cm-1 przesuwa się do 526 cm-1.19 Identyczne zachowanie tego drgania
zgodnych w fazie (ang. in-phase) drgań deformacyjnych poza płaszczyznę metinowych atomów węgla,
obserwuje się dla oksy hybrydy [αd4β h4]2, podczas gdy w widmie RR oksy hybrydy [αh4β d4]2 drganie γ21
-1
δ(Cm-H), a jego przypisanie zostało oparte na 9 cm przesunięciu pod wpływem deuterowania protonów
jest obserwowane przy 545 cm-1, czyli przy tej samej częstości, co w oksyHb.42 Natomiast, pasmo to
mostków metinowych (d4).28 Dodatkowo, przesunięcie obserwowane pod wpływem podstawienia 3,8-
występuje przy 537 i 543 cm-1, odpowiednio, w widmach oksyHbd12 i jej obu oksy hybrydach, tzn.
(CaH=CbD2) grup winylowych i 13,17-(CcH2-CdD2) grup propionowych wskazuje na znaczny wpływ tych
[αd12βh12]2 oraz [αh12βd12]2. Należy jednak zaznaczyć, że kształt widma RR w zakresie 530 – 600 cm-1
grup na skład drgania normalnego γ7. Co ciekawe, w widmie RR podjednostki α pasmo przypisane temu
oksy[αd12β h12]2 hybrydy jest podobny do kształtu widma oksyHbd12, podczas gdy oksy[αh12β d12]2 do
drganiu występuje przy nieco niższej częstości (302 cm ), aniżeli w widmie podjednostki β (304 cm ).
oksyHb. Jest to kolejne potwierdzenie dominującej roli podjednostki α w widmach RR tetrameru
Wykazuje też większą intensywność, aniżeli odpowiadające mu pasmo obserwowane w podjednostce β.
hemoglobiny.42
-1
-1
Drganie pirolu γ22 (symetria Eg) zlokalizowano przy częstości 509 cm-1 dla oksy adduktu Hb,
Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tego efektu jest istnienie silnej heterogeniczności pomiędzy
hemami α i β, a tym samym różnicy w PED tego drgania.18
podczas gdy dla adduktu CO nie jest ono widoczne w widmach RR Hb ze względu na interferencję z
Obok drgania γ7 w widmach RR hemoproteidów pojawia się drganie γ16 (B2u) obserwowane jako
intensywnym pasmem przypisanym drganiu ν(Fe-C). Drganie γ22 przesuwa się ku niższym częstościom w
pasmo przy 300-316 cm-1. Drganie to przypisano na podstawie jego „czułości” na podstawienie d12 (-6
izotopomerze d12, natomiast podstawienie protonów w mostkach metinowych (d4) nie powoduje żadnego
-1
-1
cm ) i niewielkiej zmianie częstości, jedynie o około -2 cm , przy podstawieniu d4. Przy niższych
częstościach obserwuje się jeszcze dwa inne pasma związane z deformacją pierścieni pirolowych, γ23 i γ24,
oba o symetrii Eg. Pierwsze z nich, związane z wychyleniem poza płaszczyznę, tzw. „tilting”, obserwuje
efektu.
Trzecie ze spodziewanych w tym zakresie drgań, a mianowicie γ12 (symetria B1u), jest
obserwowane dla metMb i wykazuje nieznaczne tylko przesunięcie pod wpływem podstawienia
N i
-1
się przy ~230 cm-1, a jego częstość nie zależy od podstawień izotopowych hemu d4 i d12. Natomiast
ulega przesunięciu o -8 cm dla analogów d4.
drganie γ24 obserwowane przy ~239 cm-1 przesuwa się o –6 cm-1 pod wpływem podstawienia hemu d12 i
5.4. Niskoczęstościowe drgania hemu w płaszczyźnie
W niskim zakresie częstości widm RR hemoproteidów pojawia się szereg pasm pochodzących od
nie zmienia swej częstości przy zmianie protonów przy atomach węgla Cm.
Trzy pirolowe drgania poza płaszczyznę, tj. γ12, γ21 i γ22, przypisane do pasm w zakresie częstości
500 - 600 cm-1 ulegają przesunięciom ku niższym częstościom pod wpływem podstawienia izotopowego
grup winylowych, metylowych oraz propionowych.30 Drganie γ21 (ang. „holding”) o symetrii Eg
przypisano do pasma pojawiającego się w widmach RR hemów Hb i Mb i ich
15
drgań w płaszczyźnie pierścienia hemu. Do drgań tych należą: ν9, ν52, ν8, ν50, ν51, ν33, ν25 i ν48. Z pośród
nich jedynie trzy najbardziej charakterystyczne zostaną omówione poniżej.
W przypadku deoksyMb obszar pomiędzy 240 i 310 cm-1 zawiera poszerzone, z licznymi
N analogów oraz
przegięciami, pasmo z maksimum przy 304 cm-1 (γ7) oraz pasmo przy 240 cm-1 pochodzące od drgania ν9,
55
56
15
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
δ(CβC1)sym.30 Drganie ν9 przypisano na podstawie obserwowanego 2-3 cm-1 przesunięcia ku niższym
57
częstościom pod wpływem podstawienia izotopowego dla deokyMb i metMb30 i 1-2 cm-1 dla Ni(II)(OEP-
hemu, a ich częstości pozwalają w miarę poprawnie określić wielkość wychylenia jonu żelaza poza
d4).24,83 Takie zachowanie się pasma pod wpływem wspomnianych podstawień izotopowych, jak również
płaszczyznę hemu w oparciu o równanie [12], jak również, co już wspomniano, stopień utlenienia jonu
przesunięcia się jego ku niższym częstościom w hemie-d6(2,7) (zdeuterowane grupy metylowe w
żelaza i jego liczbę spinową.
Fe. Zmiany położeń tych pasm są ściśle związane z położeniem jonu żelaza względem płaszczyzny
pozycjach 2 i 7) wskazuje, iż drganie to jest silnie sprzężone z dwoma drganiami: rozciągającym Fe-pirol i
Najdokładniej zbadano związki jonów Ni(II) z różnymi porfirynami, co pozwoliło na w miarę
zginającym fragmentu CCcCd. W widmie deoksyMb nie obserwuje się pasma przy ~270 cm-1, które
dokładne określenie drgań normalnych (PED) tych pasm wskaźnikowych. Oczywiście, skład tych drgań
pojawia się natomiast w widmie RR metMb i jest przypisane do drgania ν52.30 Pojawienie się tego drgania,
zależy od jonu metalu i rodzaju makrocyklu, jednakże dominujący wkład poszczególnych drgań w PED
które przy zakładanej symetrii D4h jest drganiem aktywnym w podczerwieni dobitnie świadczy o
drgania normalnego pozostaje zachowany. Tabela 3 podaje położenia tych pasm i ich przypisanie
obniżeniu symetrii hemu.24,83 Drganie to jest drganiem zginającym δ(Cβ-C1). Ulega ono przesunięciu o -2
odpowiednim drganiom normalnym w widmie RR Ni(II) (OEP). Natomiast rysunek 11 przedstawia
cm-1 dla d12 i d6(2,7) oraz zaskakująco aż o -8 cm-1 dla analogów d4.
widma RR deoksy i adduktów O2 i CO Hb. Zwraca uwagę dobra zbieżność częstości wyznaczonych dla
Pasmo przy ~340 cm-1 w widmach deoksy Hb i Hb-15N pochodzi od drgań γ6 i ν8, podczas gdy w
widmach adduktów CO i O2 jest bardziej złożone i dla pełnego opisu tego pasma należy uwzględnić
jeszcze dwa inne drgania, czyli ν50 i ν51, które ulegają silniejszemu wzmocnieniu RR dla płaskiej struktury
hemu. Zastosowanie podstawień izotopowych typu: d4, d6(2,7), d6(12,18), d12 i d16 pozwoliło na
jednoznaczne przypisanie powyższych pasm. W szczególności należy zwrócić uwagę na drganie γ6, które
przesuwa się w kierunku niższych częstości o około 20 cm-1 pod wpływem podstawienia d4, oraz o -7, 0 i
-7 cm-1 dla izotopomerów, odpowiednio, d12, d6(2,7) i d6(12,18), podczas gdy ν8 przesuwa się jedynie o
około 2–4, 4, 0 i 4 cm-1 ku niższym częstościom dla powyżej wspomnianych hemów. Dodatkowo,
przypisanie to zostało potwierdzone przesunięciem o -2 cm-1 dla Mb-15N .23,24,26
Ni(II)(OEP)i odpowiednich związków Hb.
Tabela 3. Obserwowane częstości pasm „markerowych” (w cm-1) dla Ni(II)(OEP) oraz przypisanie tych pasm odpowiednim
drganiom.
drganie symetria częstość (cm-1)
przypisanie (PED,%) Ni(II)(OEP)
ν2
A1g
1602
ν(CβCβ)(45) + ν(CαCm)(15) + ν(CαCβ)(11) + δ(C αCβCβ)(11)
ν3
A1g
1520
ν(CαCm)(28) + ν(CβCβ)(28) + ν(CαN)(12)
ν4
A1g
1383
ν(CαN)(34) + ν(CβCβ)(44) + δ(CαNCα)(11) + δ(CαCm)(19)
ν10
B1g
1655
ν(CαCm)(83) + δ(CmH)(14)
ν11
B1g
1577
ν(CβCβ)(70) + ν(CβC1)(11)
ν19
A2g
1603
ν(CαCm)(88) + δ(CmH)(20)
Pasmem „markerowym” określającym stopień utlenienia jonu żelaza jest drganie ν4, które
związane jest z drganiem rozciągającym całego pierścienia hemu, tzw. drganiem „oddychającym”
5.5. Zakres 1300 –1650 cm-1 w widmach RR
W wysokim zakresie widma, tzn. pomiędzy 1300 – 1650 cm-1, obserwuje się pasma, które
makrocyklu. Pasmo to przypisano w oparciu o obserwowane 3-5 cm-1 ku niższym częstościom
przesunięcie izotopowe pod wpływem podstawienia 15N w pierścieniach pirolowych. Pasmo to występuje
pozwalają zdefiniować stopień utlenienia jonu żelaza, jego liczbę spinową i liczbę koordynacyjną. Pasma
przy 1356 cm-1w deoksyHb (Fe(II)) i przesuwa się znacznie, tj. o 20-25 cm-1 ku wyższym liczbom
te, zwane także pasmami wskaźnikowymi lub markerowymi, przypisano drganiom normalnym, które w
literaturze oznaczane są jako: ν2, ν3, ν4, ν10, ν11 i ν19.22 Zostały one zdefiniowane w oparciu o
podstawienia izotopowe typu: d4,
15
N, 3-(CaD-CbH2), 8-(CaD-CbH2), 3,8-(CaD-CbH2), 3,8-(CaH-CbD2) i
57
falowym dla związków z jonem Fe(III) (oksyMb, oksyHb, związki met i cyjano). Wyjątkiem jest
położenie ν4, „aż” 1372 cm-1, w addukcje CO. Jest to związane z silną donacją elektronów π z orbitalu
antywiążącego CO do wiązania Fe-CO (ang. π-back bonding donation). Ogólnie, zmiana położenia tego
58
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
pasma spowodowana jest efektem „wyciągania” π-
poza płaszczyznę wywołując odpychanie niesparowanych elektronów na orbitalach antywiążących.
elektronów z pierścienia porfiryny (nakładanie się orbitali
Odwrotny efekt obserwuje się dla heksakoordynacyjnego kompleksu wysokospinowego, w którym jon
dπ jonu żelaza z orbitalami π* porfiryny) przez wiązanie
żelaza leży w płaszczyźnie hemu, a orbitale antywiążące obsadzone są przez dwa elektrony, co powoduje
metal-ligand oraz zmianą rozmiarów jonu żelaza Fe(II) ↔
zwiększenie rozmiaru pierścienia makrocyklicznego. Natomiast w przypadku heksakoordynacyjnego
Fe(III) ↔ Fe(IV).84
niskospinowego kompleksu, w którym jon żelaza znajduje się w płaszczyźnie, a antywiążące orbitale dπ
Pozostałe pasma „markerowe” drgań: ν2 (p), ν3 (p),
ν10 (dp), ν11 (dp) i ν19 (ap), gdzie „p” oznacza drganie
spolaryzowane, „dp” niespolaryzowane, a „ap” anomalnie
spolaryzowane, związane są nie tylko z wartościowością
pozostają nieobsadzone, następuje pomniejszenie pierścienia porfirynowego.86
Prześledzono np. zmiany struktur oscylacyjnych hemów zdeuterowanych w pozycjach mostków
metinowych, tzw. meso-d4, które monitorowano poprzez zmiany położeń odpowiednich pasm w widmach
RR.87 Badania te prowadzono dla kompleksów NO hemoglobiny. W przypadku izolowanych łańcuchów α
jonu żelaza, ale przede wszystkim z jego liczba spinową i
(stan T) zaobserwowano rozszczepienie pasma wiązania Fe-Nε (HisF8) i nieznaczne przesunięcie pasm
koordynacyjną. Wiadomo, iż rozmiar „wnętrza” hemu
„markerowych”: ν10, ν11, ν3, ν2 i ν19 w stronę wyższych częstości. W odróżnieniu, dla łańcuchów β nie
(przestrzeń pomiędzy czteroma atomami azotu pierścieni
zaobserwowano, ani rozszczepienia pasma ν(Fe-His), ani przesunięcia pasm „markerowych”. W stanie T
pirolowych), a tym samym i rozmiar całego makrocyklu
NO-Hb (w obecności IHP (IHP – heksafosforan inozytylu)) pasmo drgania ν10 ulega rozszczepieniu na
związany jest ze zmianą długości wiązań i wielkości
dwa o częstościach 1645 i 1637 cm-1. Natomiast konformer R charakteryzuje się tylko jednym pasmem
kątów mostków metinowych wiążących pierścienie pirolowe, co może powodować deformację
przy 1636 cm-1. Zauważono także 2 cm-1 przesunięcie w stronę niższych częstości przy przejściu ze stanu
płaszczyzny porfiryny. A zatem, większy rozmiar jonu Fe(II) w porównaniu z Fe(III) powoduje
R do T drgania ν2 (1604 cm-1), jak również 4 cm-1 przesunięcie w stronę wyższych częstości drgań ν19
„rozpychanie” pierścienia hemowego. Dodatkowo, rozmiar jonu metalu centralnego zmienia się wraz ze
(1588 cm-1) i ν3 (1506 cm-1). Gdy podjednostkę β podstawiono deuterowany hemem meso-d4 pasmo
stanem spinowym. W nisko-spinowym kompleksie z jonami Fe(III) i Fe(II), odpowiednio, 5 lub 6-
leżące przy 1645 cm-1 (ν10) nie zmieniło swego położenia, ale pasmo przy 1637 cm-1 (ν10) przesunęło się
elektronów walencyjnych znajduje się na orbitalach dπ. Antywiążące orbitale dz2 i dx2-y2 nie są obsadzone,
do 1624 cm-1. Podobnie, gdy podjednostkę α podstawiono hemem meso-d4 pasmo 1637 cm-1 pozostało nie
przesunięcie ramanowskie (cm-1)
Rysunek 11. Widma RR w wysokim zakresie częstości
dla form zligandowanych i deoksy hemoglobiny [E.
Podstawka,
Badania
struktur
molekularnych
hemoglobin metodą rezonansowej spektroskopii
Ramana, Praca doktorska, Uniwersytet Jagielloński,
Kraków, 2001].
a wiązanie Fe-ligand aksjalny jest krótkie i wynosi około 2.00 Å.
22
Gdy jon żelaza w kompleksie
przesunięte wskazując, że te dwie różne częstości drgania ν10 odpowiadają penta- (1645 cm-1) i
porfiryny (hemu) jest wysoko-spinowy, jeden z tych orbitali zostaje populowany, w wyniku czego
heksakoordynacyjnym (1637 cm-1) kompleksom jonu żelaza. Wynika zatem, że wiązanie Fe-Nε (HisF8)
wydłużeniu ulega wiązanie Fe-ligand aksjalny, co pociąga za sobą wydłużenie wiązania Fe-Nε (HisF8), a
zostaje zerwane w łańcuchach α. Zauważono, iż w stanie R żelazo hemów zarówno w α, jak i w
to oznacza zwiększenie rozmiaru pierścienia porfirynowego. Wykazano, że zmiana rozmiaru pierścienie
łańcuchach β, pozostaje heksakoordynacyjne i tylko w stanie T wiązanie Fe-Nε (HisF8) ulega zerwaniu.
porfiryny o 0.01 Å wywołuje różnice w położeniu pasma o 5-6 cm-1.85 Liczba koordynacyjna ma także
Wykazano również, że pod wpływem tworzenia tetrameru drgania ν3, ν2 i ν19 ulegają przesunięciu z
wpływ na rozmiar rdzenia porfiryny. W pentakoordynacyjnym kompleksie jon Fe(II) jest przemieszczony
59
60
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
wartości w przyjmowanych dla izolowanych łańcuchów α, odpowiednio o +5, +4 i –6 cm-1 w tetramerze
w stanie T, podczas gdy żadne pasmo izolowanego łańcucha β nie zmieniło swego położenia pod
wpływem tworzenia tetrameru.
6. Literatura
1.
T. J. Dines, University of Dundee, http://www.personal.dundee.ac.uk/~tjdines/Raman/
rrtheory.htm
2.
I. Wang, H. E. Van Wart w Methods in Enzymology, J. Abelson, S. P. Colowick, N. O. Kaplan, M. Simon
(red.), Academic Press, 1993, tom 226, rozdział 14, str. 319.
3.
A. C. Albrecht, J. Chem. Phys., 34 (1961) 1476.
4.
J. Konarski, Teoretyczne podstawy spektroskopii molekularnej, PWN, Warszawa, 1991.
5.
G. Herzberg, Molecular Spectra and Molecular Structure, Van Nostrand, Princeton (N. J.), 1950, wydanie 2.
6.
S. A. Asher w Methods in Enzymology, J. Abelson, S. P. Colowick, N. O. Kaplan, M. Simon (red.), Academic
Press, 1981, tom 76, rozdział 22, str. 371.
7.
J. Tang, A. C. Albrecht w Raman Spectroscopy, H. Szymański (red.), Plenum, New York, 1970, tom 2, str.
33.
8.
L. D. Barron, A. D. Buckingham, J. Chem. Soc. Chem. Commun., (1973) 152.
9.
P. W. Atkins, Molekularna mechanika kwantowa. Wstęp do chemii kwantowej, PWN, Warszawa, 1974.
10. H. Yomado, Y. Yamamoto, J. Lascombe, P.V. Huong (red.), Raman Spectroscopy, Linear and nonlinear,
1982, rozdział 2, str. 73.
11. R. J. H. Clark, B. Stewart, Struct. Bonding, 36 (1979) 1.
12. T. C. Strekas, T. G. Spiro, J. Raman Spectrosc., 1 (1973) 197.
13. F. A. Cotton, Chemical Aplications of Group Theory, Wiley, New York, 1963.
14. S. Krimm, J. Bandekar, Adv. Protein Chem., 38 (1986) 181.
15. R. A. Copeland, T. G. Spiro, Biochemistry, 26 (1987) 2134.
16. M. Nagai, K. Imai, S. Kaminaka, Y. Mizutani, T. Kitagawa, J. Mol. Struct., 379 (1996) 65.
17. M. Nagai, H. Wajcman, A. Lahary, T. Nakatsukasa, S. Nagamoto, T. Kitagawa, Biochemistry, 38 (1999)
1243.
18. E. Podstawka, C. Rajani, J. R. Kincaid, L. M. Proniewicz, Biopolymers, 57 (2000) 201.
19. E. Podstawka, J. R. Kincaid, L. M. Proniewicz, J. Mol. Struct., 596 (2001) 157.
20. P. Mak, E. Podstawka, J. R. Kincaid, L. M. Proniewicz, Biopolymers, 75 (2004) 217.
21. L. M. Proniewicz, H. Majcherczyk, Universitatis Iagiellonicae Acta Chimica, 1993.
22. J. Twardowski (red.), Biospektroskopia, PWN, Warszawa, 1990, tom 4.
23. M. Abe, T. Kitagawa, Y. Kyogoku, J. Chem. Phys., 69 (1978) 4526.
24. X.-Y Li, R. S. Czernuszewicz, J. R. Kincaid, T. G. Spiro, J. Am. Chem. Soc., 111 (1989) 7012.
25. X.-Y Li, R. S. Czernuszewicz, J. R. Kincaid, Y. O. Su, T. G. Spiro, J. Phys. Chem., 94 (1990) 31.
26. X.-Y Li, R. S. Czernuszewicz, J. R. Kincaid, P. Stein, T. G. Spiro, J. Phys. Chem., 94 (1990) 47.
27. S. Hu, A. Mukherjee, C.Piffat, R. S. W. Mak, X.-Y. Li, T. G. Spiro, Biospectroscopy 1 (1995) 395.
28. S. Hu, A. Mukherjee, T. G. Spiro, J. Am. Chem. Soc., 115 (1993) 12366.
29. X.-Y. Li, M. Z. Zgierski, J. Phys. Chem., 95 (1991) 4268.
30. S. Hu, K. M. Smith, T. G. Spiro, J. Am. Chem. Soc., 118 (1996) 12638.
31. S. Hashimoto, J. Teraoka, T. Inubishi, T. Yonetani, T. Kitagawa, J. Biol. Chem., 261 (1986) 11110.
32. T. Hayashi, T. Matsuo, Y. Hitomi, K. Okawa, A. Suzuki, Y. Shiro, T. Iizuka, Y. Hisaeda, H. Ogoshi, J. Inorg.
Biochem., 91 (2002) 94.
33. G. Smulevich, S. Hu, K.R. Rodgers, D.B. Goodwin, K. M. Smith, T. G. Spiro, Biospectroscopy, 2 (1996) 365.
34. H. Oshio, T. Ama, T. Watanabe, K. Nakamoto, Inorg. Chim. Acta, 96 (1985) 61.
35. J. R. Kincaid, C. Rajani, L. M. Proniewicz, K. Maruszewski, J. Am. Chem. Soc., 119 (1997) 9073.
36. E. Podstawka, P. Mak, J. R. Kincaid, L. M. Proniewicz, wysłane do Biopolymers
37. J. O. Alben, S. S. Choi, A. D. Alder, W. S. Caughey, Ann. N. Y. Acad. Sci., 206 (1973) 278.
38.
W. S. Caughey, H. Shimada, J. H. Hazzard, R. A. Houtchens, W. T. Potter; O. Einarsdottir, Fed. Proc. Fed.
Am. Soc. Exp. Biol, 42 (1983) 2000.
39. L. M. Proniewicz, J. R. Kincaid, Coord. Chem. Rev., 161 (1997) 81.
61
CHEMICZNE ASPEKTY BADAŃ ŚRODOWISKA
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
L. M. Proniewicz, J. R. Kincaid, J. Am. Chem. Soc., 112 (1990) 675.
Kincaid, J. R w The Porphyrin Handbook, Kodish, K. M., Smith, K. M., Guilard, R. (red.), Academic Press, New
York, 2000, tom 7, rozdział 51.
E. Podstawka, Badania struktur molekularnych hemoglobin metodą rezonansowej spektroskopii Ramana,
Rozprawa doktorska, Uniwersytet Jagielloński, Kraków, 2001.
S. Choi, T. G. Spiro, K. C. Langry, K. M. Smith, J. Am. Chem. Soc., 104 (1982) 4337.
S. Hirota, T. Ogura, T. Kitagawa, J. Am. Chem. Soc., 117 (1995) 821.
K. Uchida, Y. Susai, E. Hirotani, Y. Kimura, T. Yoneya, H. Takeuchi, I. Harada, J. Biochem., 103 (1988) 979.
S. Nakashima, T. Kitagawa, J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 10318.
K. G. Ravichandran, S.S. Boddupalli, C.A. Hasemenn, J.A. Peterson, J. Deisenhofer, Science, 261 (1993) 177.
H. Li, T. L. Poulos, Nature Struct. Biol., 4 (1994) 140.
K. G. Welinder, Curr. Opin. Struct. Biol., 2 (1992) 383.
H. A. Harper, V. W. Rodwell, P. A. Mayes w Zarys chemii fizjologicznej, PZWL, Warszawa, 1983.
E. A. Kerr, N.-T. Yu, K. Gersdone, D. W. Parish, K. M. Smith, J. Biol. Chem., 260 (1985) 12665.
A. Ghosh, D. F. Bocian, J. Phys Chem., 100 (1996) 6363.
M. Tsubaki, R. B. Srivastava, N.-T. Yu, Biochemistry, 21 (1982) 1132.
M. Tsuboi, Indian J. Pure Appl. Phys., 26(1988) 188.
E. A. Kerr, N.-T. Yu, w Biological Application of Raman Spectroscopy, T. G. Spiro (Ed.), Wiley-Interscience,
New York, 1988, tom III, rozdział 2.
X.-Y. Li, T. G. Spiro, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 6024.
G. Fermi, M. F. Perutz, B. Shaanan, R. Fourme, J. Mol. Biol., 175 (1984) 159V.
L. Pauling, Nature, 203 (1964) 182.
H. Brunner, Naturwiss, 61 (1974) 129.
M. Tsubaki, K. Nagai, T. Kitagawa, Biochemistry, 19 (1980) 379.
M. A. Walters, T. G. Spiro, D. M. Scholler, B. H. Hoffman, J. Raman Spectrosc., 14 (1983) 162.
H. E. Van Wart, J. Zimmer, J. Biol. Chem., 260 (1985) 8372.
S. Jeyarajah, L. M. Proniewicz, H. Bronder, J. R. Kincaid, J. Biol. Chem., 269 (1994) 31047.
S. Hirota, T. Ogura, E.H. Appelman, K. Shinzawa-Itoh, S. Yoshikawa, T. Kitagawa, J. Am. Chem. Soc., 116
(1994) 10564.
D. A. Hase, B. H. Huynh, M. Karplus, J. Am. Chem. Soc., 101 (1979) 4433.
M. Tsubaki, N.-T. Yu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981) 3581.
A. Bruha, J. R. Kincaid, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 6006.
K. Gersdone, K., 34’th Colloquium-Mosbaaach, Biological Oxidations, H. Sund, V. Ullrich (red.), SpringerVerlag:Berlin , 1983, str. 170.
K. Gersonde, N.-T. Yu, S.-H. Lin, K. M. Smith, D. W. Parish, D. W., Biochemistry, 28 (1989) 3960.
C. Ho, J. R. Rerussi, Method Enzymology, 97 (1994) 232.
L. Martineau, C. T. Craescu, Eur. J. Biochem., 214 (1993) 383.
K. Gersdone, N.-T. Yu, E. A. Kerr, K. M. Smith, D. W. Parish, J. Mol. Biol., 194 (1987) 545.
T. Tanaka, N.-T. Yu, C. K. Chang, Biophys., 52 (1987) 801.
S. Choi, T. G. Spiro, K. C. Langry, K. M. Smith, L. D. Budd, G. N. La Mar, J. Am. Chem. Soc., 104 (1982)
4345.
H. Lee, T. Kitagawa, M. Abe, R. K. Pandey, H.-K. Leung, K. M. Smith, J. Mol. Struct., 146 (1986) 329.
W. A. Kalsbeck, A. Ghosh, R. Pandey, K. M. Smith, D. F. Bocian, J. Am. Chem. Soc., 117 (1995) 10959.
D. A. Condirston, J. D. Liposa, J. Mol. Spectrosc., 63 (1976) 466.
E. Podstawka, L. M. Proniewicz, J. Inorg. Biochem., 98 (2004) 1502.
D. L. Rousseau, M. R. Ondrias, G. N. La Mar, S. B. Kong, K. M. Smith,
J. Biol. Chem., 258 (1983)
1740.
G. Smulevich, M. A. Miller, D. Gosztola, T. G. Spiro, Biochemistry, 28 (1989) 5058.
B. Shaanan, J. Mol. Biol., 171(1983) 31.
J. M. Baldwin, J. Mol. Biol., 136(1980) 103.
V. Jayaraman, T. G. Spiro, Biospectroscopy, 2 (1996) 311.
D. Dolphin w The Porphyrins, Academic Press, New York, Vol. 1-7 (1978-1979).
T. G. Spiro w Iron porphyrins, Lever, A. P. B., Gray, H. B., Addison-Wesley Publishing Co., Reading, MA
1983, część II, str. 89.
O. Bangcharoenparpong, K. T. Schomacker, P. M. Champion, J. Am. Chem. Soc., 106 (1984) 5688.
K. Nagai, C. Welborn, D. Dolphin, T. Kitagawa, Biochemistry, 19 (1980) 4755.
62