ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC)

Rozcieńczona próbka
Test mikropłytkowy ProSpecT™
Shiga Toxin E. coli (STEC)
5
ZAWARTOŚĆ ZESTAWU, PRZYGOTOWANIE DO
STOSOWANIA I PRZECHOWYWANIE
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) zawiera
R2474048 ....................48 testów
R2474096 ....................96 testów
1
odczynniki wystarczające do wykonania
48 lub
96 testów.
Patrz także Środki ostrożności, punkt 6.
Data ważności każdego zestawu jest podana na etykiecie opakowania.
Wszystkie komponenty przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
Przed użyciem umożliwić wszystkim odczynnikom osiągnięcie
temperatury pokojowej (20-25 °C) i delikatnie wymieszać. Po użyciu
niezużyte odczynniki umieścić w lodówce.
Wszystkie odczynniki, za wyjątkiem buforu płuczącego, są dostarczane
w stężeniu gotowym do użycia. Odczynniki można rozdzielać
bezpośrednio z butelek z zakraplaczem lub przelewać do użycia za
pomocą pipet wielokanałowych. Jeśli przelano więcej odczynnika niż
potrzeba, taką pozostałą ilość należy wylać. Nie wolno przelewać
pozostałej ilości odczynnika ponownie do butelki.
PL
PRZEZNACZENIE
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) służy do
jakościowego wykrywania toksyn Shiga (Stx1 i Stx2) w wodnych
roztworach próbek stolca i hodowlach stolca na odżywczym bulionie.
Test jest przeznaczony do stosowania jako pomoc w rozpoznawaniu
zakażeń enterokrwotocznymi szczepami bakterii E. coli.
2
OMÓWIENIE
Szczepy bakterii E. coli wytwarzające toksyny Shiga (STEC) zostały
uznane za ważne etiologiczne czynniki biegunki oraz poważnych
wybuchów i sporadycznych przypadków zagrażających życiu
krwotocznych zapaleń jelita grubego i zespołu hemolitycznomocznicowego (HUS2,3,13,14 ). Szczepy bakterii E. coli powodujące takie
skutki zostały po raz pierwszy opisane przez Konowalchuk et al., który
zidentyfikował cytotoksynę, która wywołuje działanie cytopatyczne w
linii komórek Vero i została ona nazwana werotoksyną, VT 6,7,8 .
Pokrewieństwo cytotoksyny i toksyny Shiga zostało wykazane przez
O’Brien et al.9, który nazwał toksynę toksyną Shiga-podobną (SLT).
Zidentyfikowano dwa typy toksyn, Stx1 i Stx2 9 i udowodniono, że
wytwarzające toksynę Shiga izolaty E. coli (STEC) wytwarzają jedną
lub obie cytotoksyny 15,16 . E. coli O157:H7 jest najczęściej
rozpoznawanym serotypem enterokrwotocznych szczepów Escherichia
coli (EHEC) i może zostać wyizolowany i rozpoznany w większości
laboratoriów klinicznych1,10,12,14 . Jednakże co najmniej 50 serotypom
szczepu E. coli przypisuje się wytwarzanie cytotoksyn i wywoływanie
zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS) i/lub krwotocznego
zapalenia jelita grubego5,11. Karmali 4 opisał metodę wykonywania testu
cytotoksycznego wykrywającego toksyny, ale test ten wymaga
poświęcenia znacznej ilości czasu i doświadczenia analityka dla
potwierdzenia obecności cytotoksyn. Test mikropłytkowy ProSpecT
Shiga Toxin E. coli (STEC) jest immunoenzymatycznym testem
pozwalającym na bezpośrednie wykrycie obecności toksyn Stx1 i Stx2
w próbkach stolca lub hodowlach stolca na odżywczym bulionie.
3
Instrukcja użytkowania
Pipety transferowe
Uchwyt pasków mikropłytek i pokrywa
Karta procedury
Mikropłytka* (8 studzienek / pasek)
6 pasków (R2474048) lub 12 pasków
(R2474096) opłaszczonych króliczym
przeciwciałem poliklonalnym przeciwko
toksynie Shiga 1 i 2. Niezużyte paski
mikropłytek przechowywać w worku
foliowym ze środkiem osuszającym w celu
wyeliminowania wilgoci.
Koniugat enzymu*
Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca
12 ml (R2474048) lub 25 ml (R2474096)
monoklonalnego przeciwciała mysiego
znakowanego peroksydazą chrzanową
przeciwko toksynie Shiga 1 i 2 ze środkami
przeciwbakteryjnymi.
Kontrola dodatnia
Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca
4 ml supernatantu hodowli E. coli
zawierającego toksyny Shiga 1 i 2 z płodową
surowicą bydlęcą, surowicą króliczą i środkami
przeciwbakteryjnymi.
ZASADA DZIAŁANIA TESTU
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) jest
immunologicznym testem fazy stałej do wykrywania toksyn Shiga.
Rozcieńczone próbki stolca są dodawane do odłamywanych studzienek
mikropłytek, na których związane są poliklonalne królicze przeciwciała
toksyn Shiga 1 i 2. Jeżeli toksyny są obecne, są one przechwytywane
przez związane przeciwciało. Studzienki są poddawane inkubacji a
następnie przemywane w celu usunięcia niezwiązanego materiału.
Dodawany jest koniugat enzymu (mysie przeciwciało monoklonalne
toksyn Shiga 1 i 2 znakowane enzymem peroksydazy chrzanowej).
Studzienki są poddawane inkubacji a następnie przemywane w celu
usunięcia niezwiązanego koniugatu enzymu. W reakcji dodatniej toksyna
wiąże koniugat enzymu do studzienki. Dodawany jest substrat dla
enzymu, 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyna (TMB). W reakcji dodatniej
enzym związany ze studzienką za pomocą toksyny zamienia substrat
na produkt reakcji kolorymetrycznej. Wybarwienie można obserwować
wzrokowo lub spektrofotometrycznie. W reakcji ujemnej nie ma toksyny
lub obecne jest niedostateczne stężenie toksyny do wiązania koniugatu
enzymu i nie pojawia się żaden produkt reakcji kolorymetrycznej.
4
Kontrola ujemna
Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca
4 ml zbuforowanego roztworu z surowicą
króliczą, czerwonym barwnikiem i środkami
przeciwbakteryjnymi.
Rozcieńczalnik do próbek bakteryjnych
Jedna butelka zawierająca 120 ml
zbuforowanego roztworu z surowicą króliczą,
czerwonym barwnikiem i środkami
przeciwbakteryjnymi.
Bufor płuczący
Jedna butelka zawierająca 120 ml (x10)
skoncentrowanego roztworu buforu ze
środkami przeciwbakteryjnymi.
10-krotny koncentrat buforu płuczącego (x10)
należy rozcieńczać dodając (x1) 1 część
koncentratu do 9 części wody destylowanej
lub dejonizowanej. Rozcieńczony bufor
płuczący zachowuje stabilność przez 1
miesiąc, jeśli jest przechowywany w
temperaturze 2 - 8 °C.
DEFINICJE SYMBOLI
Numer katalogowy
Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro
Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań
Sprawdzić w instrukcji stosowania (IFU)
Temperatury graniczne (temperatury
przechowywania)
Substrat zabarwienia
Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca
12 ml (R2474048) lub 25 ml (R2474096)
3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyny (TMB) w
buforze.
Kod serii (numer serii)
Stosować do (data ważności)
Producent
1
Substrat zabarwienia należy przechowywać i
pobierać z butelki chroniącej przed dostępem
światła, w której jest dostarczony. Jeśli z
dowolnego powodu pobrano porcję substratu
z oryginalnej butelki, nie wolno ponownie
dodawać niezużytej objętości substratu
zabarwienia do oryginalnej butelki.
6.15
Roztwór zatrzymujący reakcję
Jedna butelka z zakraplaczem zawierająca
12 ml 0,46 mol/l kwasu siarkowego.
*Uwaga: Nie zamieniać odczynników pomiędzy zestawami o różnych
numerach serii.
6.17
6
6.16
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI:
6.18
Odczynniki są przeznaczone do stosowania wyłącznie w diagnostyce
in vitro.
Wyłącznie do profesjonalnego stosowania.
Informacje na temat ewentualnych szkodliwych składników znajdują się
w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa Materiału (MSDS) i na
etykietach produktu.
6.19
INFORMACJE DOTYCZĄCE BHP
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
Odczynniki są przygotowywane z materiałów biologicznych i
należy je traktować jako materiał potencjalnie zakaźny. Usuwać
stosując procedury odpowiednie dla materiałów stanowiących
zagrożenie biologiczne.
Nie pipetować ustami. Podczas postępowania z próbkami i
wykonywania analizy należy nosić jednorazowe rękawiczki i
okulary ochronne. Po zakończeniu procedury dokładnie umyć
ręce.
Próbki mogą zawierać czynniki potencjalnie zakaźne i należy je
traktować jako Poziom biozagrożenia 2 zgodnie z zaleceniem w
podręczniku Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorób/Krajowego
Instytutu Zdrowia (CDC/NIH) pt. „Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories” (Bezpieczeństwo biologiczne w
laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych), wyd. 5.
Bufor płuczący zawiera substancje działające potencjalnie
uczulająco na skórę (< 1% v/v). Unikać kontaktu ze skórą. Nosić
jednorazowe rękawiczki winylowe lub nitrylowe.
Bufor płuczący usuwać w odpowiednich pojemnikach dla
materiałów stanowiących zagrożenie biologiczne.
7
6.7
6.8
6.9
6.10
6.11
6.12
6.13
6.14
POBIERANIE PRÓBEK STOLCA
W przypadku bezpośredniego badania próbek stolca optymalne wyniki
zostaną uzyskane, jeśli próbki stolca są badane niezwłocznie po
dostarczeniu do laboratorium. Jeżeli test zostanie wykonany w ciągu
48 godzin od pobrania świeżych próbek lub w ciągu 7 dni w przypadku
próbek w pożywce transportowej Cary Blair, próbki można
przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C, w pozostałych wypadkach próbki
należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej.
ŚWIEŻE Niezakonserwowane próbki (lub próbki w pożywce
transportowej Cary Blair) natychmiast po pobraniu należy przechowywać
w temperaturze 2 - 8 °C lub zamrożone w temperaturze -20 °C lub
niższej. Próbki zebrane dla hodowli należy umieścić w bulionie w ciągu
jednej do dwóch godzin po dostarczeniu próbki do laboratorium.
Próbki stanowiące zawiesinę lub rozcieńczone w rozcieńczalniku do
próbek bakteryjnych można przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez
48 godzin przed wykonaniem testu.
ZAMROŻONA Jeżeli hodowli nie można wykonać w ciągu 1-2 godzin,
świeże lub zakonserwowane w Cary Blair próbki zebrane dla hodowli
należy zamrozić w temperaturze -20 °C lub niższej.
Wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania mogą spowodować rozkład
toksyny.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
6.6
Osoby nie rozpoznające kolorów lub z uszkodzeniem wzroku
mnoga nie być w stanie odczytać wizualnie testu i powinny
stosować odczyt spektrofotometryczny w celu zinterpretowania
wyników.
Podczas całej procedury odczynniki dodawać do studzienek testu
w takiej samej kolejności. Aby uniknąć skażenia, nie wolno
dotykać płynu w studzienkach końcówkami butelek.
Dokładnie mierzyć czas każdej inkubacji. Rozpocząć pomiar
czasu po dodaniu odczynnika do ostatniej studzienki na każdej
badanej mikropłytce. W celu zapewnienia dokładnego pomiaru
czasu jednorazowo badać nie więcej niż trzy płytki z 96
studzienkami. Odchylenie od ustalonej procedury może zmienić
wynik badania.
Ważne jest utrzymywanie butelek z zakraplaczami w pozycji
pionowej, aby kropla tworzyła się na zakończeniu dyszy. Jeśli
dysza stanie się wilgotna, zamiast na końcówce, wokół
zakończenia dyszy powstanie kropla o nieodpowiedniej objętości.
Jeśli to nastąpi, należy osuszyć dyszę przed kontynuowaniem
zakraplania.
Toksyna Shiga 1 i toksyna wytwarzana przez szczepy Shigella
dysenteriae typ 1 (toksyna Shiga) są niemal identyczne. Dlatego
test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) może
dać wynik dodatni, jeżeli w próbce znajdzie się wykrywalna ilość
toksyny Shiga.
Dokładnie przeczytać i postępować zgodnie z niniejszą
„Instrukcją użycia”.
Z wyjątkiem koncentratu buforu płuczącego odczynniki
dostarczono w wymaganym stężeniu roboczym. Nie rozcieńczać
odczynników, z wyjątkiem, jeśli tak polecono.
Nie wolno stosować odczynników po upływie podanego terminu
ważności. Termin ważności jest wydrukowany na każdej etykiecie
odczynnika. Stosowanie odczynnika po terminie ważności może
wpłynąć na dokładność wyników.
Poniższe wspólne odczynniki mogą być używane w serii
produktów ProSpecT: bufor płuczący, substrat zabarwienia i
roztwór zatrzymujący reakcję.
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne odczynników może
zmniejszyć dokładność testu. Unikać zanieczyszczenia
mikrobiologicznego odczynników stosując sterylne jednorazowe
pipety podczas pobierania części odczynnika z butelek.
Przed użyciem wszystkie odczynniki i próbki należy pozostawić
do osiągnięcia temperatury pokojowej (20-25 °C).
Paski mikropłytek należy przechowywać w zamykanych
torebkach foliowych ze środkiem pochłaniającym wilgoć w celu
ochrony studzienek mikropłytek przed wilgocią.
Próbki stolca należy dokładnie wymieszać przed przygotowaniem
próbek w celu zapewnienia jednolitej zawartości próbki. NIE
WYKONYWAĆ KONCENTRATU PRÓBKI PRZED BADANIEM.
Substrat zabarwienia jest wrażliwy na światło. Jeśli odczynnik
zostanie wystawiony na działanie światła i pojawi się zabarwienie,
odczynnik należy wyrzucić.
8
SPOSÓB WYKONANIA TESTU
WYMAGANE MATERIAŁY DOSTARCZONE
Patrz Zawartość zestawu, rozdział 5
MATERIAŁY NIEZBĘDNE, LECZ NIE DOSTARCZONE
Pojemniki do pobierania próbek stolca
Stoper do pomiaru minut
Butelka na bufor płuczący
Woda destylowana lub dejonizowana
MATERIAŁY OPCJONALNE, NIE DOSTARCZANE
Czytnik mikropłytek odpowiedni do odczytu przy długości fali
450 nm lub 450/620 do 650 nm
Aplikatory z końcówkami bawełnianymi lub wiskozowymi
Mikropipeta do dostarczania objętości do 200 µl
Jednorazowe probówki, plastikowe lub szklane
Wytrząsarka typu Vortex z adapterem do płytek lub wytrząsacz
PROCEDURA
8.1
2
Przygotowanie do testu: Próbki w pożywce transportowej Cary
Blair można dodawać bezpośrednio do studzienek mikropłytek
do badania (patrz punkt 8.4 poniżej). Przed przeniesieniem do
studzienki mikropłytki upewnić się, że próbki są wymieszane w
pożywkach transportowych. Świeże próbki stolca lub hodowle w
odżywczym bulionie należy rozcieńczyć (patrz ramka A lub B
poniżej).
A
Bezpośrednie badanie próbek stolca
1
Dodać 0,6 ml rozcieńczalnika do próbek bakteryjnych do
czystej probówki 12 x 75 mm.
2
d
Jak najdokładniej wymieszać próbkę stolca i odpowiednio
rozcieńczyć:
Płynne lub półpłynne próbki stolca: za pomocą pipety do
przenoszenia dodać 0,3 ml (trzecie oznaczenie od końca na
załączonej pipecie). Dokładnie wymieszać próbkę stolca z
rozpuszczalnikiem próbek bakteryjnych i pozostawić pipetę
do przenoszenia w probówce.
Próbki stolca w postaci stałej: za pomocą aplikatora dodać
0,3 g (około 6 mm średnicy). Rozpuścić próbkę stolca w
rozpuszczalniku próbek bakteryjnych i umieścić pipetę do
przenoszenia w probówce.
Próbki stolca w pożywce transportowej Cary Blair należy
dodawać bezpośrednio do studzienek mikropłytek bez
dalszego rozcieńczania.
Zawiesiną z próbką wymieszać na wytrząsarce typu Vortex.
3
PRZEJŚĆ DO KROKU 8.2
B
Metoda bulionu
1
Zaszczepić 50 µl lub 50 µg (porcja wielkości niewielkiego
ziarnka grochu) świeżej próbki stolca lub stolca w pożywce
transportowej Cary Blair w 5 ml bulionu tryptozowo-sojowego
(TSB), zmodyfikowanego bulionu tryptozowo-sojowego
(mTSB) lub w bulionie MacConkey.
2
Inkubować w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.
3
Dodać 0,6 ml rozcieńczalnika do próbek bakteryjnych do
czystej probówki 12 x 75 mm.
4
Przenieść 0,3 ml hodowli bulionu do 0,6 ml rozcieńczalnika
próbek bakteryjnych za pomocą pipety do przenoszenia.
Pozostawić pipetę do przenoszenia w probówce.
5
PRZEJŚĆ DO KROKU 8.2
a
b
c
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
8.10
8.11
8.12
8.13
9
Dodać 1 kroplę (50 µl) roztworu zatrzymującego reakcję do
każdej studzienki. Delikatnie postukać lub wytrząsać studzienki
aż do jednorodnego zabarwienia na żółto. Odczytać reakcje w
ciągu 10 minut po dodaniu roztworu zatrzymania reakcji.
Odczytywać wzrokowo lub spektrofotometrycznie przy długości
fali 450 nm (pojedyncza długość fali) lub przy długości fali od
450/620 do 650 nm (podwójna długość fali).
KONTROLA JAKOŚCI
Podczas przeprowadzania każdego testu należy uwzględnić kontrolę
dodatnią i ujemną. Kontrole ujemna i dodatnia służą jako odczynniki i
kontrole procedury. Kontrole są przeznaczone do monitorowania
istotnych nieprawidłowych zachowań odczynników. Kontrola dodatnia
nie zapewnia precyzji dla wartości granicznej testu.
Gęstość optyczna (O.D.) kontroli ujemnej powinna wynosić < 0,100 przy
450 nm lub < 0,070 przy długości fali 450/620 do 650 nm. Kontrola
ujemna powinna być bezbarwna podczas odczytu wzrokowego. Jeśli w
kontroli ujemnej obecne jest żółte zabarwienie odpowiadające
oznaczeniu 1+ lub większemu na Karcie procedury, test należy
powtórzyć zwracając szczególną uwagę na procedurę płukania.
Gęstość optyczna kontroli dodatniej powinna być > 0,500 przy 450 nm
lub 450/620 do 650 nm i powinna być równa lub większa niż reakcja 2+
odczytywana wizualnie. Jeśli w kontroli dodatniej żółte zabarwienie jest
mniejsze niż 2+ na Karcie procedury należy zwrócić się o pomoc
techniczną.
10
WYNIKI
W interpretacji zabarwienia należy posłużyć się załączoną Kartą
procedury.
ODCZYT WIZUALNY
10.1
Otworzyć torebkę foliową, wyjąć wymaganą liczbę pasków
mikropłytek i umieścić je w uchwycie pasków mikropłytek. Należy
wykorzystać jedną studzienkę na kontrolę ujemną i jedną
studzienkę na kontrolę dodatnią. W przypadku użycia mniej niż
8 studzienek, należy odłamać wymaganą liczbę studzienek od
paska i umieścić nie wykorzystane studzienki z powrotem w
torebce foliowej z pochłaniaczem wilgoci. SZCZELNIE ZAMKNĄĆ
TOREBKĘ, ABY ZABEZPIECZYĆ PRZED WILGOCIĄ I
UMIEŚCIĆ Z POWROTEM W LODÓWCE.
Dodać 4 krople (200 µl) kontroli ujemnej do studzienki A1. Dodać
4 krople (200 µl) kontroli dodatniej do studzienki B1.
Za pomocą pipety do przenoszenia dodać 4 krople (200 µl)
rozcieńczonej próbki lub nierozcieńczonej próbki stolca w
pożywce transportowej Cary Blair do każdej studzienki.
Uwaga: Umieścić otwór pipety do przenoszenia tuż wewnątrz
studzienek, aby uniknąć rozpr yskiwania do sąsiednich
studzienek.
Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej
(20 - 25 °C) przez 60 minut. Po dodaniu ostatniej próbki
rozpocząć pomiar czasu.
Wytrząsnąć lub odessać zawartość studzienek. Przepłukać
napełniając całkowicie każdą studzienkę rozcieńczonym
buforem płuczącym (~350-400 µl /na każdą studzienkę).
Wytrząsnąć lub odessać cały płyn ze studzienek po każdym
płukaniu. Przepłukać łącznie 3 razy. Po ostatnim płukaniu usunąć
zawartość i wystukać płytkę na czystych ręcznikach papierowych
lub odessać. Usunąć jak najwięcej buforu płuczącego, ale przez
cały czas nie pozwalać na wyschnięcie studzienek.
Dodać 4 krople (200 µl) koniugatu enzymu do każdej studzienki.
Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej
(20 - 25 °C) przez 30 minut.
Wytrząsnąć lub odessać i przepłukać każdą studzienkę 5 razy
jak w kroku 8.6.
Dodać 4 krople (200 µl) substratu barwiącego do każdej
studzienki.
Przykryć mikropłytkę i inkubować w temperaturze pokojowej
(20 - 25 °C) przez 10 minut.
10.2
Odczytać wyniki testu porównując z zabarwieniem reakcji na
Karcie procedury.
Dodatni: żółte zabarwienie o intensywności przynajmniej 1+.
Ujemny: bezbarwne.
Niejednoznaczny: zabarwienie jasno żółte, poniżej reakcji 1+.
Interpretacja wyników wizualnych:
Dodatni: Jeśli w badanej studzience pojawi się żółte zabarwienie
o intensywności równej co najmniej 1+, wówczas próbka zawiera
toksynę Stx1 lub Stx2 lub obie toksyny i wynik testu jest dodatni.
Ujemny: Reakcja bezbarwna oznacza wynik ujemny i wskazuje
na brak toksyn Stx1 i Stx2 lub niewykrywalne stężenie toksyn w
badanej próbce.
Niejednoznaczny: Jeśli pojawi się słabe żółte zabarwienie,
poniżej reakcji 1+, wynik badania jest niejednoznaczny. Wyniki
niejednoznaczne należy powtórzyć. Jeśli wynik ponownego
badania jest dodatni, próbka jest dodatnia. Jeśli wynik ponownego
badania jest ujemny, próbka jest ujemna. Jeśli wynik ponownego
badania jest niejednoznaczny, należy uzyskać inną próbkę i
wykonać badanie.
ODCZYT SPEKTROFOTOMETRYCZNY
10.3
10.4
10.5
3
Odczytać wyniki przy pojedynczej (450 nm) lub podwójnej (450/
620 do 650 nm) długości fali.
Odczytać wyniki testu:
A. Pojedyncza długość fali
Dodatni: gęstość optyczna > 0,150
Ujemny: gęstość optyczna < 0,100
Niejednoznaczny: gęstość optyczna 0,100 - 0,150.
B. Podwójna długość fali
Dodatni: gęstość optyczna > 0,100
Ujemny: gęstość optyczna < 0,070
Niejednoznaczny: gęstość optyczna 0,070 - 0,100
Interpretacja wyników spektrofotometrycznych:
Dodatni: Odczyt gęstości optycznej większy niż 0,150 (przy
pojedynczej długości fali) lub większy niż 0,100 (przy podwójnej
długości fali) oznacza wynik dodatni i wskazuje na obecność
toksyny Stx1 i/lub Stx2.
Ujemny: Odczyt gęstości optycznej poniżej 0,100 (przy
pojedynczej długości fali) lub poniżej 0,070 (przy podwójnej
długości fali) oznacza wynik ujemny i wskazuje brak toksyny
Stx1 lub Stx2 lub obydwu lub niewykrywalne stężenie toksyn w
badanej próbce.
Niejednoznaczny: Odczyt gęstości optycznej między
0,100-0,150 (przy pojedynczej długości fali) lub 0,070-0,100
(przy podwójnej długości fali) jest niejednoznaczny. Wyniki
niejednoznaczne należy powtórzyć. Jeśli wynik ponownego
badania jest dodatni, próbka jest dodatnia. Jeśli wynik ponownego
badania jest ujemny, próbka jest ujemna. Jeśli wynik ponownego
badania jest niejednoznaczny, należy uzyskać inną próbkę i
wykonać badanie.
Uwaga: Wszystkie próbki, które są w odczycie wizualnym
bezbarwne, ale dają odczyt gęstości optycznej niespójny z
interpretacją wzrokową należy uznać za odczyt rozbieżny i
sprawdzić, czy w studzienkach obecne są pęcherzyki powietrza,
małe cząstki, lub czy na spodzie studzienki znajduje się
nieprzezroczysta warstwa. W celu usunięcia warstwy przetrzeć
spód studzienek i odczytać gęstość optyczną ponownie. Jeśli
nadal występuje rozbieżność pomiędzy odczytem wzrokowym i
odczytem gęstości optycznej, powtórzyć test.
11
ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) jako świeże próbki i jako
namnażane przez noc na wzbogaconym podłożu. Wszystkie próbki
badano również testem cytotoksycznym (CTA) na obecność toksyn
Shiga. Próbki z dodatnim wynikiem badania na obecność toksyn Shiga
były izolowane i serotypowane (patrz tabela 3). Na wszystkich dodatnich
i rozbieżnych próbkach wykonano test amplifikacji wyłącznie do celów
badawczych za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na
obecność genu toksyn Shiga. Wyniki wszystkich ośrodków badania
przedstawiono w tabelach 1 i 2. W metodzie bezpośredniego badania
było 20 dodatnich próbek (EIA+, CTA+, PCR+). Były 3 próbki EIA-,
CTA+, PCR+. Było 5 próbek EIA+, CTA-, PCR-. Wszystkie wyniki
niejednoznaczne zostały uznane za rzeczywiście ujemne. 354 próbki
były ujemne w badaniach dwoma metodami (EIA-, CTA-). Ogólne
początkowe i potwierdzone wyniki testu mikropłytkowego ProSpecT
Shiga Toxin E. coli (STEC) przedstawiono poniżej w tabeli 1.
Tabela 1. Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli
(STEC) w porównaniu z testem cytotoksycznym na
bezpośrednich próbkach stolca.
OGRANICZENIA ZWIĄZANE Z PROCEDURĄ
Bezpośrednie badanie próbek
Początkowe wyniki
Potwierdzone wyniki*
Poprawność wyników testu mikropłytkowego ProSpecT Shiga Toxin
E. coli (STEC) zależy od wykonania reakcji kontrolnych zgodnie z
oczekiwaniami. Patrz „Kontrola jakości”, punkt 9.
Ujemny wynik testu nie wyklucza możliwości obecności toksyn Shiga i
może wystąpić, gdy stężenie antygenu w próbce jest poniżej progu
wykrycia testu. Nie ustalono korelacji pomiędzy ilością antygenu w
próbce a obecnością kliniczną.
Tak jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych IN VITRO,
lekarz powinien interpretować wyniki testu w połączeniu z objawami
klinicznymi lub innymi wynikami laboratoryjnymi.
Prawidłowe pobieranie i przygotowanie próbek ma istotne znaczenie
dla uzyskania optymalnych wyników testu. Optymalne wyniki testu są
uzyskiwane z próbek badanych jak najszybciej po pobraniu. Patrz
„Pobieranie próbek stolca”, punkt 7.
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) został
zaklasyfikowany jako test o dużej złożoności.
12
ProSpecT
Ośrodek
badania nr 1
ProSpecT
Test cytotoksyczny
+
-
Niejedn.
+
-
Niejedn.
+
-
12
1
2
156
0
4
+
-
12
1
2
161
0
0
Niejedn.
0
1
0
Niejedn.
0
0
0
Łączna liczba próbek: 176
Czułość:
92,3%
Swoistość:
98,7%
ProSpecT
Ośrodek
badania nr 2
WARTOŚCI OCZEKIWANE
176
92,3%
98,7%
Test cytotoksyczny
ProSpecT
Test cytotoksyczny
+
-
Niejedn.
+
-
+
8
3
0
+
8
3
0
Niejedn.
2
0
186
0
6
1
Niejedn.
2
0
193
0
0
0
Łączna liczba próbek: 206
Czułość:
80,0%
Swoistość:
98,4%
Przynajmniej 50 różnym serotypom szczepu E. coli (STEC)
wytwarzającym toksyny Shiga przypisuje się wytwarzanie cytotoksyn i
powodowanie zagrażających życiu krwotocznego zapalenia jelita
grubego i zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS) - poważnego
powikłania powodującego niewydolność nerek, trombocytopenię i
niedokrwistość. Chociaż do grupy wysokiego ryzyka zachorowania na
HUS w wyniku zakażenia szczepem E. coli wytwarzającym toksyny
Shiga zalicza się przede wszystkim małe dzieci, również inne podgrupy
są zagrożone zakażeniem STEC, w tym osoby starsze i osoby z
obniżonym poziomem odporności.
Jak wykazały wyniki badań klinicznych testu mikropłytkowego ProSpecT
Shiga Toxin E. coli (STEC), w badanych próbkach obecne były różne
typy serotypów. Testy na zakażenie STEC nie powinny być ograniczone
do badania wykrywającego jedynie serotyp O157:H7. Należy również
zwrócić uwagę, że nie zawsze istnieje bezpośredni związek między
wynikami badań bezpośrednich i na odżywczym bulionie. Może to być
spowodowane między innymi następującymi przyczynami: a.) toksyna
może być obecna w próbce stolca w wykrywalnym stężeniu, ale komórki
STEC mogą już być nieżywe i nie nadawać się do hodowli; b.) izolowane
szczepy E. coli O157 z hodowli stolca pacjentów są odwrotnie
proporcjonalne do odstępu czasowego między pojawieniem się biegunki
i hodowlą mikrobiologiczną17; c.) toksyna może być obecna w próbce
stolca w stężeniu niewykrywalnym przez test, a komórki STEC mogą
być nadal żywe i nadawać się do hodowli; oraz d.) leczenie
antybakteryjne może wpływać na zdolność komórek STEC do hodowli.
13
Test cytotoksyczny
ProSpecT
Łącznie
Niejedn.
206
80,0%
98,5%
Test cytotoksyczny
ProSpecT
+
- Niejedn.
Test cytotoksyczny
+
- Niejedn.
+
20
5
0
+
20
5
0
Niejedn.
3
0
342
1
10
1
Niejedn.
3
0
354
0
0
0
Łączna liczba próbek: 382
Czułość:
87,0% (66,4 - 97,2)
Swoistość:
98,6% (96,7 - 99,5)
Korelacja:
95,0% (92,3 - 97,0)
382
87,0% (66,4 - 97,2)
98,6% (96,6 - 99,5)
97,9% (95,9 - 99,1)
Liczby w nawiasach stanowią przedziały ufności 95%.
*Tabele wyników potwierdzonych pokazują wyniki powtórzonego testu
immunoenzymatycznego EIA na próbkach, które były początkowo
niejednoznaczne.
Jak widać w tabeli 1, wykazano 97,9% korelację w metodzie
bezpośredniego badania próbek dla potwierdzonych danych między
testem mikropłytkowym ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) a testem
cytotoksycznym po zestawieniu wyników z obydwu ośrodków badania.
W metodzie hodowli w bulionie odżywczym były 63 dodatnie próbki
(EIA+, CTA+, PCR+). Były 3 próbki EIA-, CTA+, PCR-. Po powtórzeniu
testu cytotoksycznego CTA wynik 2 z 3 próbek potwierdzono jako
rzeczywiście ujemny. Było 10 próbek EIA+, CTA-, PCR-. Wszystkie
wyniki niejednoznaczne zostały uznane za rzeczywiście ujemne po
powtórzeniu testu. 771 próbek było ujemnych w badaniach dwoma
metodami (EIA-, CTA-). Ogólne początkowe i potwierdzone wyniki testu
mikropłytkowego ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) przedstawiono
w tabeli 2.
CHARAKTERYSTYKA TESTU
CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) został oceniony
w trzech geograficznie odległych badaniach klinicznych na terenie
Stanów Zjednoczonych, Kanady i Niemiec. Ośrodki uczestniczące w
badaniu to Metropolitan Hospital w Virginii w Stanach Zjednoczonych,
szpital dziecięcy w Toronto w Kanadzie i duża instytut mikrobiologiczny
w Niemczech. Populacje pacjentów reprezentowane w puli próbek to
pacjenci z objawami w populacjach zdrowych dorosłych pacjentów i
dzieci. Próbki były niezakonserwowane i badane testem mikropłytkowym
4
Tabela 2. Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli
(STEC) w porównaniu z testem cytotoksycznym na hodowlach
stolca w odżywczym bulionie.
ProSpecT
Ośrodek
badania nr 1
Tabela 3. Liczba różnych serotypów szczepów E. coli
wytwarzających toksyny Shiga wyizolowanych z dodatnich
próbek.
Hodowle w odżywczym bulionie
Początkowe wyniki
Potwierdzone wyniki*
Serotyp
Test cytotoksyczny
ProSpecT
+
- Niejedn.
O8:H9
Liczba wyizolowanych szczepów
Serotypy
Test cytotoksyczny
+
- Niejedn.
Stx1
Stx2
Stx1 i 2
Stx2c
Nieznany Razem
1
O26:H11
7
2
1
1
3
13
O30
1
+
12
1
0
+
12
1
0
O88:H5
1
1
Niejedn.
0
0
160
0
3
0
Niejedn.
0
0
163
0
0
0
O91
1
3
1
3
Łączna liczba próbek: 176
Czułość:
100%
Swoistość:
99,4%
ProSpecT
Ośrodek
badania nr 2
+
-
O103:H2
1
O111:NM
2
O118
2
O128
2
O145
1
1
2
Niejedn.
O153:H2
1
1
2
176
100%
99,4%
Test cytotoksyczny
ProSpecT
Niejedn.
Test cytotoksyczny
+
-
2
+
9
0
0
+
9
0
0
O157:H7
Niejedn.
1
0
192
0
4
0
Niejedn.
1
0
196
0
0
0
O166
1
Typy toksyn łącznie
19
Łączna liczba próbek: 206
Czułość:
90,0%
Swoistość:
100%
ProSpecT
Ośrodek
badania nr 3
+
Niejedn.
206
90,0%
100%
Test cytotoksyczny
+
-
Niejedn.
42
2**
0
9
410
0
0
0
0
ProSpecT
+
Niejedn.
ProSpecT
Łącznie
+
Niejedn.
63
3
0
10
762
0
0
7
0
Łączna liczba próbek: 845
Czułość:
95,5% (87,3 - 99,1)
Swoistość:
98,7% (97,6 - 99,4)
Korelacja:
97,6% (96,4 - 98,5)
+
Niejedn.
2
2
7
9
2
16
10
2
+
-
Niejedn.
42
0
0
9
412
0
0
0
0
1
10
771
0
3
50
Konsystencja stolca
Wodnista Miękka Śluzowata Wodnista/ Miękka/ Krwawa
Śluzowata Śluzowata
Liczba stolców
119
134
41
17
50
30
Toksyny Shiga +
8
5
5
0
2
7
Cytotoksyny +
10
5
5
1
3
7
CZUŁOŚĆ ANALITYCZNA
Test mikropłytkowy ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) wykrywa około
52 pg/ml toksyny Stx1 i 126 pg/ml toksyny Stx2.
Test cytotoksyczny
+
- Niejedn.
63
1
0
18
Tabela 4. Testy dodatnie toksyn Shiga według konsystencji
próbki stolca
463
100%
97,9%
Test cytotoksyczny
ProSpecT
+
- Niejedn.
1
Test cytotoksyczny
Łączna liczba próbek: 463
Czułość:
95,5%
Swoistość:
97,9%
1
ODTWARZALNOŚĆ
0
0
0
Współczynnik zmienności (CV) pomiędzy testami mikropłytkowymi
ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) został oceniony poprzez wybranie
jednej ujemnej i trzech dodatnich próbek o różnych odczytach gęstości
optycznej. Każda próbka była badana w 24 studzienkach na test w
trzech kolejnych powtórzeniach. Średni CV pomiędzy testami wynosił
8,69%.
845
98,4% (91,6 - 100)
98,7% (97,7 - 99,4)
98,7% (97,7 - 99,3)
Próbka
Liczby w nawiasach stanowią przedziały ufności 95%.
*Tabele wyników potwierdzonych pokazują wyniki powtórzonego testu
immunoenzymatycznego EIA na próbkach, które były początkowo
niejednoznaczne.
** Należy zwrócić uwagę, że w ośrodku badania nr 3 były 2 początkowo
fałszywie dodatnie wyniki testu cytotoksycznego CTA, które po
powtórzeniu testu cytotoksycznego okazały się ujemne.
Jak widać w tabeli 2, wykazano 98,7% korelację w metodzie hodowli na
bulionie odżywczym dla potwierdzonych danych między testem
mikropłytkowym ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC) a testem
cytotoksycznym po zestawieniu wyników ze wszystkich ośrodków
badania.
Różne serotypy szczepu E. coli wytwarzającego toksyny Shiga zostały
zbadane testem mikropłytkowym ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC)
i uznane za reaktywne w bezpośrednim badaniu próbek stolca lub z
bulionu odżywczego. Poniżej podano wykaz badanych serotypów, liczbę
próbek z danym serotypem i rodzaj toksyny wytwarzanej przez każdy
szczep, jeżeli jest znana.
1
2
3
4
Średnia gęstość
optyczna
Odchylenie
standardowe
%CV
0,065
0,264
0,675
0,830
0,0101
0,0176
0,0270
0,0703
15,61%
6,67%
4,00%
8,48%
Współczynnik zmienności (CV) w jednym teście oceniono poprzez
zbadanie każdej z 4 próbek w 24 studzienkach. Średni wynik CV w
ramach jednego testu wynosił 4,59%.
Próbka
1
2
3
4
Średnia gęstość
optyczna
Odchylenie
standardowe
%CV
0,069
0,274
0,563
1,226
0,0055
0,0134
0,1490
0,0340
8,01%
4,90%
2,65%
2,78%
REAKCJE KRZYŻOWE
Podczas badania różnych organizmów mikroflory ludzkich jelit za
pomocą testu mikropłytkowego ProSpecT Shiga Toxin E. coli (STEC)
nie wystąpiły żadne reakcje krzyżowe. Test przeprowadzono za pomocą
hodowli niżej wymienionych organizmów w próbkach stolca ujemnych i
dodatnich w kierunku obecności toksyn Shiga. Hodowlę bakterii
wykonano w stężeniach > 1 x 10 7 CFU/ml na próbkę stolca. Szczepy
patogenne E. coli nie wytwarzające toksyn Shiga (EPEC, ETEC, EIEC)
zostały również zbadane testem ProSpecT i wykazały wynik ujemny.
Campylobacter jejuni ATCC® 29428
Citrobacter braakii ATCC® 43162
Enterobacter cloacae ATCC® 13047
Escherichia coli ATCC® 33660
Escherichia coli, EIEC, ATCC® 43893 (O124:NM)
5
Escherichia coli, EPEC, ATCC® 12014 (O55:NM)
Escherichia coli, EPEC, ATCC® 33780 (O111:NM)
Escherichia coli, ETEC/EPEC, ATCC® 43887 (O111:NM)
Escherichia coli, VT ujemna, ATCC® 25922
Enterococcus faecalis ATCC® 49149
Klebsiella pneumoniae ATCC® 27736
Proteus vulgarus, ATCC® 33420
Pseudomonas aeruginosa ATCC® 27853
Salmonella typhimurium, SA972229
Serratia liquefacians ATCC® 27592
Shigella dysenteriae ATCC® 49347
Shigella flexneri ATCC® 25929
Shigella sonnei, ATCC® 25931
Staphylococcus aureus ATCC® 25923
Yersinia enterocolitica ATCC® 23715
14
PIŚMIENNICTWO
1.
Johnson, W.M., H. Lior, and G.S. Bezanson, 1983.
Cytotoxic Escherichia coli O157:H7 Associated with Haemorrhagic Colitis
in Canada.
Lancet pp. 76.
2.
Karmali, M.A., B.T. Steele, M. Petric, and C. Lim, 1983.
Sporadic Cases of Haemolytic Uraemic Syndrome Associated with Faecal
Cytotoxin and Cytotoxin-Producing Escherichia coli.
Lancet pp.619-620.
3.
Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P.C. Fleming, G.S. Arbus, and H. Lior,
1985.
The Association Between Haemolytic Uraemic Syndrome and Infection
by Verotoxin-Producing Escherichia coli.
J. Infect. Dis. 151(5): 775-782.
4.
Karmali, M.B., 1987.
Laboratory Diagnosis of Verotoxin-Producing Escherichia coli Infections.
Clin. Microbiol. Newsletter. 9(9): 65-70.
5.
Kleanthous, H., H.R. Smith, S. M. Scotland, R.J. Gross, B. Rowe, C. M.
Taylor, and D.V. Milford. 1990.
Haemolytic uraemic syndrome in the British Isles, 1985-8: association
with Verocytotoxin producing Escherichia coli. Part 2. Microbiological
aspects.
Am. J. Dis. Child. 65:722-727.
6.
Konowalchuk, J., I. Speirs, and S. Stavric. 1977.
Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli.
Infect. Immun. 18(3): 775-779.
7.
Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs. 1978,
Properties of an Escherichia coli Cytotoxin.
Infect. Immun. 20: 575-577.
Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs, 1978.
Comparative Studies of Five Heat-labile Toxic Products of Escherichia
coli.
Infect. Immun. 22:644-648.
8.
9.
O’Brien, A.D., G.D. LaVeck, M.R. Thompson, and S.B. Formal, 1982.
Production of Shigella dysenteriae type 1-like Cytotoxin by Escherichia
coli.
J. Infect. Dis. 144(6):763-769.
10.
O’Brien, A.D., T.A. Lively, M.E. Chen, S.W. Rothman, and S.B. Formal,
1983.
Escherichia coli O157:H7 Strains Associated with Haemorrhagic Colitis in
the United States Produce a Shigella dysenteriae I (Shiga)-like Cytotoxin.
Lancet pp.702.
11.
O’Brien, A.D. and R.K. Holmes. 1987.
Shiga and Shiga-like Toxins.
Microbiol. Rev. 51(2): 206-220.
12.
Pai, C.H., R. Gordon, H.Y. Sims, and L.E. Bryan, 1984.
Sporadic Cases of Haemorrhagic Colitis Associated with Escherichia coli
O157:H7.
Ann. Intern. Med. 101: 738-742.
13.
Pai, C. H., N. Ahmed, H. Lior, W.M, Johnson, H.V. Sims, and D.E. Woods,
1988.
Epidemiology of Sporadic Diarrhea Due to Verocytotoxin-Producing
Escherichia coli; A Two-year Prospective Study.
J. Infect. Dis. 157(5):1054-1057.
14.
Riley, L.W., R.S. Remis, S.D. Helgerson, H.B. McGee, J.G. Wells, B.R.
Davis, R.J. Hebert, E.S. Olcott, L.M. Johnson, N.T. Hargrett, P.A. Blake,
and M.L. Cohen, 1983.
Haemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype.
N. Engl. J. Med. 308(12): 681-685.
15.
Scotland, S.M., H.R. Smith, and B. Rowe, 1985.
Two Distinct Toxins Active on Vero Cells from Escherichia coli O157.
Lancet. pp.885-886.
16.
Strockbine, N., L. Marques, J. Newland, H. Williams Smith, R.K. Holmes,
and A.D. O’Brien, 1986.
Two Toxin-Producing Phages from Escherichia coli O157:H7 Strain 933
Encode Antigenically Distinct Toxins with Similar Biologic Activities.
Infect. Immun. 53(1):135-140.
17.
Karch, H., et al., 1996.
Isolation of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 Strains from
Patients with Haemolytic-Uraemic Syndrome by Using Immunomagnetic
Separation, DNA-Based Methods, and Direct Culture.
JCM, March 1996, 34(3):516-519.
ProSpecT TM jest zarejestrowanym znakiem towarowym
ATCC® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy American Type Culture
Collection.
Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants,
RG24 8PW Wielka Brytania
W celu uzyskania pomocy technicznej należy skontaktować się z
lokalnym dystrybutorem.
Instrukcja użycia X7594,
zmieniona 27 października 2008 r.
6
Wydrukowano w Wielkiej Brytanii