Pełny tekst - Wydawnictwa NIZP-PZH

ROCZN. PZH, 1999, 50, N R 4, 421^126
JOANNA LESZC ZYŃ SK A
M O D Y F IK A C JA E N Z Y M A T Y C Z N E J M E T O D Y O Z N A C Z A N IA
CH O LESTERO LU
M O DIFICATION O F EN ZY M A TIC M ETH OD O F CH O LESTERO L D E TER M IN A TIO N
Zespół Chemii Bionieorganicznej i Analitycznej
Instytut Podstaw Chemii Żywności Politechniki Łódzkiej
90-924 Łódź, ul. Stefanowskiego 4/10,
Kierownik: prof. dr hab. J. Masłowska
W pracy zastosowano enzymatyczną metodę oznaczania cholesterolu. Do
określania aktywności peroksydazy użyto substraty, które w wyniku reakcji dają
fluoryzujące produkty. Opracowaną metodę zastosowano do oznaczania chole­
sterolu w przetworach mięsnych. Oznaczona zawartość cholesterolu wynosiła od
40,2 do 150,0 i nie odbiegała od wartości otrzymanych przez innych autorów.
Współczynnik korelacji użytej metody oraz metody enzymatycznej - kolory­
metrycznej wynosił 0,998.
WSTĘP
N ajczęstszym i przyczynam i zgonów w P olsce o b ec n ie są c h o ro b a n ie d o k rw ie n n a
serca i zaw ały o raz u dary m ózgu. Przyczyną tych ch o ró b je st niepraw idłow y m e tab o lizm
lipidów , często spow odow any nad m iern y m spożyciem tłuszczów , zw łaszcza zw ierzęcych.
W sk aźn ikiem praw idłow ego m etabolizm u lipidów je st zaw arto ść ch o lestero lu , k tó r e ­
go pozio m je st często skorelow any z p o ziom em lipidów . C h o leste ro l je st n iezb ęd n y do
w łaściw ego fu n kcjonow ania organizm u. Szkodzi d o p ie ro je g o n ad m iar.
Z w iązek ten, ja k o składnik żółci, uczestniczy w p ro ce sie traw ien ia, je s t p o trze b n y
do p ro d u k cji horm o n ó w , zw łaszcza płciow ych, ale rów nież antystresow ych. U m ożliw ia
przysw ajanie w itam iny D. B ierze tak że u dział w budo w an iu k o m ó rek m ózgu w czasie
intensyw nego rozw oju w o k re sie w czesnego dzieciństw a.
Występowanie cholesterolu i jego rola
C h o le ste ro l je st p re k u rso re m wszystkich innych stero id ó w w o rg an izm ie takich jak:
k o rty k o stero idy, h o rm o n y płciow e, kwasy żółciow e i w itam in a D. Je st typow ym p r o ­
d u k te m m e tab o lizm u zw ierzęcego, a więc zn ajd u je się w p o k arm a ch p o c h o d z en ia
zw ierzęcego takich jak: żó łtk a ja ja, m ięso, w ątro b a , m ózg. W u stro ju człow ieka z n a jd u je
się on w ilości o k o ło 250 g, głów nie w m ózgu i n ad n erczach . W osoczu krwi c h o le ste ­
rolu je st 150 - 200 m g /l00 cm 3, a je g o ilość w zrasta przy niek tó ry ch sc h o rz en ia ch .
W w aru n k ac h patologicznych zw iązek ten m oże osadzać się w n arz ąd ac h i tk an k ach
422
J. Leszczyńska
Nr 4
np. w p o staci kam ien i w przew odach żółciow ych o raz w ścian ach naczyń krw ionośnych
przy m iażdżycy.
Z a w a rto ść c h o le ste ro lu w e krwi nie pow inna p rzek raczać 200 m g/dl. O k o ło połow a
c h o le ste ro lu w o rg an izm ie człow ieka p ochodzi z syntezy, a p o z o sta ła ilość je s t d o s ta r­
czana z pożyw ieniem . O k o ło 50% zsyntetyzow anego ch o lestero lu p o ch o d zi z w ątroby,
15% z je lit, a zn aczn a część ze skóry.
W ciągu je d n e g o d n ia z org an izm u w ydala się o k o ło 1 g ch o lestero lu . P raw ie p o ło ­
w a, p o p rze k szta łc en iu w kwasy żółciow e, je st w ydalana z kałem , p o z o sta ła część w p o sta ci o b o jętn y ch steroidów . Z n a c z n a część ch o lestero lu w y d alan a z żółcią je st
p o n o w n ie w ch ła n ia n a w je lita ch , a n astę p n ie w ychw ytyw ana p rzez w ą tro b ę i p o n o w n ie
w y d alan a z żółcią. Z jaw isko to je st z n a n e ja k o k rąż en ie je lito w o - w ątro b o w e.
W celu o b n iż en ia zbyt w ysokiego p oziom u ch o lestero lu p o w in n a być sto so w a n a d ie ta
n isk o c h o le stero lo w a, k tó ra zaw iera m ożliw ie ja k najw ięcej p ro d u k tó w bogaty ch w b ło n ­
nik - pieczyw a razow ego, grubych kasz, roślin strączkow ych, w arzyw i ow oców . N ależy
rów nież u n ik a ć stresów , a przynajm niej sta ra ć się go rozładow yw ać, re g u la rn ie upraw iać
sp o rt.
Metody wykrywania i oznaczania cholesterolu
C h e m ic zn e m eto d y w ykryw ania i o zn aczan ia ch o lestero lu o p ie ra ją się za sad n iczo na
dw óch reak cjach. P od w pływ em stężo n eg o kw asu siarkow ego d o ch o d zi d o o d ciąg n ięcia
cząsteczek w ody. T w orzy się czerw ony kw as disulfonow y b ic h o lestiad ien u (odczyn
Salkow skiego).
W o b ecn ości kw asu siarkow ego i bezw odnika kw asu o ctow ego tw orzy się zielono
zab arw io n y kw as m onosulfonow y b ic h o lestiad ien u (odczyn L ieberm anna-B urcharda).
Ślady w ody u niem ożliw iają reak cję [11].
Z n a n e są ta k że m etody enzym atyczne z zastosow aniem esteraz y ch o lestero lo w ej,
oksydazy i peroksydazy [4, 9]. C h o leste ro l o zn a cz an o tak że za p o m o c ą czujników
enzym atycznych, skonstruow anych w o p arciu o e le k tro d ę tlen o w ą [5]. W o statn ich
latach sto so w an e są rów nież m eto d y ch ro m a to g rafii gazow ej [1, 6, 8, 10], w tym także
k ap ilarn ej [7] o ra z H P L C [2, 7]. C hociaż m etody ch ro m a to g raficz n e, ja k o d o k ład n iejsze
i p ro stsze, są n ajb ard ziej p o le ca n e d o oznaczan ia ch o lestero lu , to ró w n ież m eto d y
enzy m aty czne są czułe, precyzyjne i nie w ym agają drogiej ap a ratu ry .
Enzymatyczna metoda oznaczania cholesterolu
423
Inten sy w ność cz erw onego zabarw ienia o trzym anej p o ch o d n e j je st p ro p o rc jo n a ln a d o
stężenia ch o lestero lu . D o po m iaró w fluorym etrycznych używ ano sp e k tro flu o ry m e tr
firmy H itachi.
Z a sto so w an a m odyfikacja m etody niniejszej pracy poleg a n a użyciu fluoryzujących
substratów dla peroksydazy.
CZĘŚĆ DOŚW IADCZALNA
Odczynniki i roztwory
Część odczynników pochodziła z zestawu do oznaczania cholesterolu firmy Aqua-med (Łódź),
który zawiera: odczynnik Ri (0,1 mol/dm3 bufor fosforanowy pH 6,8; cholan sodu 1 g/dm3),
odczynnik R2 (liofilizat: esterazy cholesterolowej, oksydazy cholesterolowej, peroksydazy) oraz
wzorzec cholesterolu 200 mg/100 cm3. Pozostałe odczynniki: kwas fenylooctowy, lumionol, kwas
homowanilinowy, kwas p-hydroksyfenylomlekowy zostały zakupione w firmie Sigma.
Przygotowanie próbki
1
g zhomogenizowanej próbki wyrobu mięsnego (np. pasztetu) ekstrahowano trzykrotnie
porcjami izopropanolu po 5 cm3, zbierając ekstrakty w kolbce pojemności 25 cm3. Następnie
dodawano 5 cm' HC1 o stężeniu 8 mol/dm3, uzupełniano izopropanolem do kreski i wstawiano
do lodówki na okres 20 min. w celu oddzielenia tłuszczu. Próbkę przesączano przez bibułę
filtracyjną. W ten sposób oznaczano cholesterol wolny.
W celu oznaczenia cholesterolu całkowitego najpierw przeprowadzano hydrolizę estrów cho­
lesterolu. W tym celu stosowano metanolowy roztwór КО Н o stężeniu 1,0 m ol/dm \ 5 cm3 tego
roztworu dodawano do odważonej próbki i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w ciągu 25 min.
stosując mieszanie za pomocy mieszadła magnetycznego. Następnie przeprowadzano ekstrakcję
za pomocą kilku porcji 5 cm' izopropanolu na gorąco, po ostudzeniu filtrowano i uzupełniano
w kolbie miarowej do kreski izopropanolem.
Sposób wykonania oznaczenia cholesterolu
Odczynnik roboczy przygotowywano w ten sposób, że zawartość buteleczki z odczynnikiem
R2 rozpuszczano w odczynniku Ri i mieszano. W celu wykonania oznaczenia przygotowywano
następujące próbki wg schematu.
Schemat przygotowania mieszanin inkubacyjnych (cm3)
W celu wykonania oznaczenia zawartości cholesterolu, do przygotowanej w oparciu o powyż­
szy schemat mieszaniny inkubacyjnej, w kuwecie kwarcowej dodawano 0,5 cm' roztworu kwasu
p - hydroksyfenylooctowego i mierzono intensywność świecenia po 15 minutach.
WYNIKI I ICH OM ÓW IENIE
W tab eli I zestaw iono długości fal: w zbudzającej i em isji d la poszczególnych su b ­
strató w peroksydazy. P oniew aż okazało się, że kwas p-hydroksyfenylooctow y m a n a j­
424
J. Leszczyńska
Nr 4
wyższy w skaźnik m olow ej em isji (2,93 x 106), te n zw iązek w ykorzystano w dalszych
o zn a cz en iach . O d ch y le n ie sta n d a rd o w e i w spółczynnik zm ien n o ści w m e to d z ie spektro fo to m etry c zn e j z w ykorzystaniem fen o lu i 4 -am inoanty p iry n y o ra z w m e to d z ie fluorym etrycznej kształtow ały się na pod o b n y m poziom ie. Je d n a k ż e o sta tn ia m e to d a c h a ­
rak te ry z o w ała się znacznie niższą g ran ic ą oznaczalności. W ynosiła o n a 0,4 ng/m l
w p o ró w n a n iu d o 5 (ig/m l w m e to d zie sp e k tro fo to m etry czn ej.
Tabela
I.
Długości fali wzbudzającej (EX) i emisji (EM ) dla poszczególnych substratów
Tabela
II.
Zestawienie wyników oznaczania cholesterolu uzyskanych m etodą fluorymetryczną
Enzymatyczna metoda oznaczania cholesterolu
425
W tabeli II przedstaw iono wyniki oznaczania całkowitej zawartości cholesterolu
otrzymane m etodą enzym atyczną z fluorymetrycznym pom iarem aktywności peroksydazy. Mieściły się one w norm ach przyjętych dla danych produktów i nie odbiegały od
wartości podawanych przez innych autorów. W spółczynnik korelacji między m etodą
spektrofotom etryczną w oparciu o test enzymatyczny firmy A quam ed a m etodą fluorymetryczną wynosił 0,998.
WNIOSKI
1. Zastosow anie fluoryzujących substratów do oznaczania aktywności peroksydazy
w m etodzie enzymatycznej pozwala na ponad dziesięciokrotne obniżenie granicy
oznaczalności tego związku.
2. Peroksydaza jest często stosowana w różnych oznaczeniach enzymatycznych i immunoenzym atycznych. Celowe wydaje się być użycie kwasu p-hydroksyfenylooctowego do oznaczania jej aktywności, gdyż wiąże się to z możliwością wykry­
wania znacznie mniejszych zawartości danych związków.
J.
Leszczyńska
M O DIFICATION O F ENZYM ATIC M ETHOD O F CHO LESTERO L D ETERM IN A TIO N
Summary
Fluorimetric substrates for peroxidase activity determining were descirbed in this work so
that to establish cholesterol concentration by enzymatic method, p-hydroxyphenyloacetate acid
was used, as the most favourable, so that to determine cholesterol content in meat products.
Using of this compound enables to diminish cholesterol determining limit more than 10-times.
Obtained results of cholesterol content are convergent with results obtained by the other authors.
PIŚMIENNICTWO
1. Aguello E., Gelos, B.S.: Gas - liquid chromatographic determination of the total and free
cholesterol in egg pastes, Food Research Int. 1996, 29, 77-80.
2. A m eth W., Al.-Ahm ad H.: Cholesterol. Its determination in muscle and adipose tissue and
in offal using HPLC, Fleiwirtschaft 1995, 75, 1001-1003.
3. Bergmayer. Methods of enzymatic analysis, Pergamon Press.
4. Dong-Кик L., Joung-Jwa A., Hae-Soo K : Comparison of gas chromatographic method with
enzymatic methodfor cholesterol determination in milk and cream, Foods and Biotechnology
1997, 6, 322-324.
5. Jung-ho K , Tai-Jin K , Dong-Нее R., Bong-Soo N.\ Simultaneous determ ination of glucose,
lactate and cholesterol using an oxygen electrode with the multiple cathode system, Food
Sci. Biotech. 1998, 7, 28-34.
6. King A.J., Paniangvait P., Jones A.D., German J.B.: Rapid method for quntification of
cholesterol in turkey meat and products, J. Food Sci. 1998, 63, 382-385.
7. Moraschiello G., DiazJ., Garcia-Regueiro J.A.: Determination of cholesterol in fat and muscle
of pig by HPLC and cappilary gas chromatography with solvent venting injection, H RC
1996, 19, 165-168.
8. Naeemi E.D., Nissar A.A., Sharrah Т.К.: Rapid and simple method for determ ination of
cholesterol in processed food, Journal of AOAC Int. 1995, 78, 1522-1525.
9. Pasin G., Smith G.M., O ’Mahony М.: Rapid determination of total cholesterol in egg yolk
using commercial diagnostic cholesterol reagent, Food Chem. 1998, 61, 255-259.
426
J. Leszczyńska
10. Peterson E., Am ado R.: Simplified method for the simultaneous gas chromatografie deter­
mination of fatty acid composition and cholesterol in food, Lebensm.-Wissenschaft und
Technologie 1997, 30, 202-209.
11. Stmszyński М.: Jakościowa analiza organiczna, PWN 1960.
Otrzymano: 1999.02.08