reologiczna analiza fizycznych właściwości

reologiczna analiza fizycznych właściwości

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 6, 407–411
ANNA ZALEWSKA, ZENON J. KOKOT
REOLOGICZNA ANALIZA FIZYCZNYCH WŁAŚCIWOŚCI KWASU HIALURONOWEGO
RHEOLOGICAL ANALYSIS OF THE PHYSIACAL PROPERTIES OF HYALURONIC ACID
Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. Zenon J. Kokot
Streszczenie
Wstęp. Kwas hialuronowy jest naturalnym polisacharydem, wchodzącym w skład płynu synowialnego. Jego właściwości reologiczne pochodzą od jego struktury i budowy (długie łańcuchy).
Cel. Cel pracy stanowiła analiza reologiczna wodnych roztworów kwasu hialuronowego.
Materiał i metodyka. Przeprowadzono analizę właściwości reologicznych kwasu hialuronowego. Jego charakterystykę opisano,
korzystając również z matematycznego modelu Szulmana.
Wyniki. Analizowane związki kwasu hialuronowego w roztworach wodnych wykazują właściwości nienewtonowskie, pseudoplastyczne, posiadają charakter cieczy rozrzedzonych ścinaniem.
Wnioski. Badanie właściwości reologicznych kwasu hialuronowego za pomocą matematycznych modeli stwarza możliwość jego
kompleksowej charakterystyki, co jest ważnym czynnikiem w prognozowaniu procesów chorobowych.
SŁOWA KLUCZOWE: ciecze nienewtonowskie, krzywe płynięcia, modele reologiczne.
Summary
Introduction. Hyaluronic acid HA is a natural polysacharide. It plays an important role as a component of the synowial fluid. Its
rheological properties originate from its structure.
Aim. Rheological analysis of the hyaluronic acid.
Material and method. In order to fully use the experimental data of the HA the system was described by mathematical models such
as Szulman model.
Results. It was concluded that the tested solution of HA, shows properties of non-Newtonian and pseudoplastic fluids.
Conclusions. It was found that Szulman model can be treated as good approximations of the real flow of the HA. The knowledge
of the rheological parameters has considerable importance in medical analysis of the hyaluronic acid especially in prognosis of the
human disease.
KEY WORDS: non-Newtonian fluid, flow curve, rheological model.
Wstęp
Reologia farmaceutyczna jak i medyczna, jako nauka
stosowana, musi adaptować dla swoich celów osiągnięcia
reologii teoretycznej, formułowanej z punktu widzenia
mechaniki ośrodków ciągłych i to zarówno w części metodologicznej, jak również wykorzystywanych terminów.
Przez ponad sześćdziesiąt lat rozwoju reologii, zarówno jej zakres tematyczny, jak również dyscyplin
naukowych z nią związanych znacznie się rozszerzył.
Obecnie przyjmuje się, że jest to nauka interdyscyplinarna, zajmująca się różnymi aspektami odkształcania ciał
rzeczywistych pod wpływem naprężeń zewnętrznych.
Rozwój reologii medycznej, jak i farmaceutycznej nastąpił głównie wraz z badaniami nad związkami wielkocząsteczkowymi, wykazującymi złożone właściwości przy
opisie których nieprzydatne okazują się parametry stosowane w przypadku roztworów małocząsteczkowych.
Reologia zajmuje się zachowaniem substancji, które
w trakcie odkształcania wykazują więcej niż jedną podstawową właściwość reologiczną, taką jak sprężystość lub
lepkość. Opisuje więc zjawiska, które występują w bardzo
szerokim zakresie pośrednim między stanem stałym i płynnym, rozważanym zupełnie odrębnie w mechanice klasycznej [1, 2, 3].
Jest to nauka pozwalająca na analizę płynów ustrojowych wykazujących cechy cieczy nienewtonowskich
np. krew, ślina czy płyn synowialny.
Płyn synowialny jest ważnym składnikiem stawów. Torebka stawowa zamyka jamę stawową, utrzymuje kości
w stawie; często jest wzmocniona więzadłami i stanowi
miejsce przyczepu ścięgien. Składa się z dwóch warstw:
zewnętrznej – włóknistej i wewnętrznej – maziowej. Warstwa zewnętrzna zbudowana jest z włókien kolagenowych,
fibroblastów i fibrocytów.
Błona maziowa wyściela jamę stawową, nie posiada
błony podstawnej, tworzy fałdy i kosmki, co zwiększa
jej powierzchnię (np. w stawie kolanowym powierzchnia
ma 110 cm kwadratowych). Błona maziowa obejmuje
dwie warstwy:
→ synowialną (stratum synoviale), czyli wyściółkową zbudowaną z 2–3 warstw komórek synowialnych =
synoviocyty (owalne komórki z wypustkami, z dużym
centralnie umieszczonym jądrem; dzieli się je na komórki
408
Anna Zalewska, Zenon J. Kokot
A = M – fagocyty z licznymi lizosomami oraz komórki
B = F przypominające fibroblasty, mają zdolność sekrecji
białek i kwasu hialuronowego, z rozbudowanym ER, AG).
W stanach zapalnych wzrasta ilość komórek A, czyli M.
→ subsynovialną (podwyściółkową) zbudowaną z komórek łącznotkankowych (fibroblasty, histiocyty, komórki
tuczne), włókien kolagenowych i sprężystych zatopionych
w substancji podstawowej. Do warstwy podwyściółkowej
wnikają naczynia krwionośne i limfatyczne.
Jama stawowa wypełniona jest mazią – synovia (nazwę
wprowadził Paracelsus). Maź to przesącz osocza krwi (pozbawiony fibrynogenu). Kwas hialuronowy łączy się z tym
przesączem tworząc maź. W stawie kolanowym występuje
do 3,5 ml mazi. Lepkość mazi zapewnia mucyna produkowana przez synoviocyty; pH mazi wynosi 7,2–7,4. Jest
płynem klarownym, bezbarwnym lub słomkowym. Odżywia chrząstkę (dyfuzja, aktywny transport przez chondrocyty i wtłaczanie przez ucisk), zmniejsza tarcie, zapewnia
przyleganie powierzchni chrzęstnych. Temperatura w stawie kolanowym wynosi 34 stopnie Celsjusza. Gdy staw
intensywnie pracuje temperatura podnosi się o 1 stopień.
W stanach zapalnych temperatura wzrasta do 37 stopni
i więcej. Wysoka temperatura przyspiesza niszczenie włókien kolagenowych. Ciśnienie wewnątrz stawu jest niższe
(ujemne) od ciśnienia atmosferycznego, dzięki czemu powierzchnie stawowe przywierają do siebie. Stany zapalne
powodują wzrost ciśnienia i uszkodzenie stawu (bóle,
obrzęk, wysięk) [4, 5, 6].
Analiza reologiczna płynu synowialnego jest niezwykle
ważna ze względu na jego istotną rolę w procesie poruszania się. Jego właściwości zmieniają się w zdrowych stawach w trakcie poruszania, jak i w stanach chorobowych.
Płyn synowialny składa się w 70% z wody, resztę stanowią
białka plazmowe, gama globuliny, albuminy, oraz polisacharydy, takie jak kwas hialuronowy.
Kwas hialuronowy jest naturalnym polisacharydem,
jego właściwości reologiczne pochodzą od jego struktury
i budowy (długie łańcuchy).
Stężenie tego kwasu, jak i masa cząsteczkowa maleje
u ludzi chorych, a jego spadek w płynie synowialnym jest
ważnym czynnikiem prognozującym choroby. W stanach
chorobowych lepkość kwasu hialuronowego również spada,
co może być spowodowane zmianami składu białek [7, 8, 9].
Dlatego też w poszukiwaniu kompleksowej oceny właściwości fizycznych płynu synowialnego, a w szczególności kwasu hialuronowego, zwrócono uwagę na metody reologiczne, a zwłaszcza analizy reometrycznej, która umożliwia ilościowy opis tych złożonych zjawisk, korzystając
z modeli matematycznych.
W literaturze podejmowano różne próby opisu krzywej
uogólnionego płynu newtonowskiego odpowiednim matematycznym modelem reologicznym. Są one bowiem niezbędne przy rozwiązywaniu zagadnień związanych z przepływem płynów nienewtonowskich [10].
Do najbardziej znanych modeli reologicznych należą
model potęgowy Ostwalda-de Waele, model wielomianowy, model Ellisa, model Binghama, model HerschelaBulkleya oraz model Szulmana.
Model potęgowy zaproponowany przez Ostwalda i de
Waele opisuje krzywe płynięcia uogólnionych płynów
newtonowskich w zakresie pośrednich szybkości ścinania.
Został on wyprowadzony ze stwierdzenia, że dla płynów
pseudoplastycznych zależność lnτ = f(lnD), gdzie τ – jest to
naprężenie ścinające a D – szybkość ścinania daje się często przybliżyć linią prostą w określonym zakresie szybkości
ścinania. Wadą tego modelu jest trudność ekstrapolacji
danych doświadczalnych w kierunku mniejszych prędkości
ścinania. Również współczynnik k ze względu na swój
wymiar, zależy od wykładnika n. Dla różnych substancji
może się więc zmieniać nie tylko ilościowo, ale także jakościowo, zatem parametry te mają jedynie sens fizyczny
tylko wtedy, gdy rozpatrywane są łącznie.
Aby opis danych doświadczalnych był pełniejszy wielu autorów zaproponowało stosowanie matematycznych
modeli reologicznych o bardziej złożonej budowie niż
model potęgowy. Opisują one zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania dla wszystkich płynów reostabilnych nie mających granicy płynięcia, zarówno rozrzedzonych, jak i zagęszczonych ścinaniem, czego przykładem może być model wielomianowy, model Ellisa,
model Sisko i inne [11, 12].
Właściwości cieczy można opisać matematycznymi
modelami reologicznymi, które umożliwiają również wyznaczenie granicy płynięcia, czyli granicznego naprężenia
ścinającego, przy którym układ zaczyna płynąć, lepkości
plastycznej badanych układów, a także parametrów n (wykładnik płynięcia) i m (wykładnik konsystencji).
Najprostszym modelem opisującym własności reologiczne nieliniowych płynów plastycznolepkich jest model Herschela-Bulkelya [13].
Krzywe płynięcia, w zależności od miejsca przecinania osi naprężenia ścinającego w punkcie τy, określają
wartość granicy płynięcia, którą można również ilościowo charakteryzować za pomocą modelu matematycznego zaproponowanego przez Binghama.
Istnieje wiele modeli reologicznych opisujących płyny
nienewtonowskie. Uważa się jednak, że tylko te przedstawione powyżej są na tyle proste, iż mogą być przydatne
w zastosowaniach analitycznych.
Na podstawie analizy dużej liczby danych reometrycznych różnych autorów Szulman zaproponował uogólniony
model. Zaletą tego modelu jest to, że stanowi on uogólnienie wielu modeli reostabilnych zarówno mających, jak i nie
mających granicy płynięcia. W szczególnych przypadkach
bowiem sprowadza się on do modelu Newtona (τy = 0, m =
n); modelu Ostwalda-de Waele (τy = 0); modelu Binghama
(n = m = 1); modleu Herschela-Bulkleya (n = 1); czy modelu Cassona (m = n) [13].
Cel
Cel pracy stanowiła analiza reologiczna wodnych roztworów kwasu hialuronowego. W badaniach uwzględniono
również wykorzystanie matematycznego modelu reologicznego Szulmana w opisie ich właściwości fizycznych.
Reologiczna analiza fizycznych właściwości kwasu hialuronowego
Materiał i metoda
Odczynniki: sól sodowa kwasu hialuronowego otrzymana z flory bakteryjnej Streptococus pyogenes w stężeniach 0,2%, 0,4%, 0,5% (Calbiochem).
Aparatura: Rheometrics Rotation Fluid Spectrometer
RFS II (stożek-płytka), wiskozymetr rotacyjny Rheotest
2-Medingen, stożek – cylinder. Pomiary zostały przeprowadzone w temperaturze 25 °C, przy szybkości ścinania od 1,5 do 1312 s-1.
Do opisu właściwości reologicznych badanych roztworów zastosowano matematyczny model Szulmana
stanowiący uogólnienie wielu modeli płynów reostabilnych, mających jak i nie mających granicy płynięcia.
Z równania tego wyznaczono, za pomocą Solvera, (część
programu Microsoft Excel z pakietu Office) parametry
reologiczne modelu τy, ηp., n oraz m. Do wyznaczenia
tych parametrów zastosowano również algorytmy genetyczne, stanowiące programy, które w sposobie rozwiązywania problemów naśladują procesy ewolucji. Ideą
algorytmu jest wybranie metody analitycznej, która jest
najlepsza [14, 15, 16, 17].
1
n
1
n
τ = τ y + (η p ⋅ D )
1
m
409
wzór dla modelu Szulmana
Wyniki
Na rycinie 1. i 2. przedstawiono zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania, oraz zależność
lepkości dynamicznej dla rosnących wartości szybkości
ścinania, czyli tzw. krzywe płynięcia i krzywe lepkości
badanych roztworów kwasu hialuronowego.
Stwierdzono, że wykazują one przebieg krzywych
płynięcia typowy dla układów nienewtonowskich. W miarę
wzrostu szybkości ścinania ich lepkość dynamiczna
maleje, co jest właściwością cieczy pseudoplastycznych.
Przy wzrastających szybkościach ścinania cząsteczki
cieczy ustawiają się w kierunku przepływu. Łańcuchowe
molekuły mogą się rozplątywać, rozciągać i ustawiać
równolegle do działającej siły, co ułatwia im przesuwanie się względem siebie. Płyny stają się rzadsze.
Jest to tzw. drugi obszar przepływu nienewtonowskiego,
gdzie lepkość zmniejsza się w wyniku orientacji molekuł.
Rycina 1. Zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego.
Figure 1. Shear stress versus shear rate for hyaluronic acid.
Rycina 2. Zależność lepkości dynamicznej od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego.
Figure 2. Viscosity versus shear rate for hyaluronic acid.
410
Anna Zalewska, Zenon J. Kokot
W celu uzyskania pełniejszej analizy reologicznej
układów nienewtonowskich wykorzystano modele matematyczne. Na rycinie 3. przedstawiono krzywe modelowe wyznaczone metodą solvera, które znajduje minimum
lokalne z sumy kwadratów naprężenia doświadczalnego
i obliczonego oraz metodą algorytmów genetycznych dla
0,5% kwasu hialuronowego. Wykazano, że model Szulmana dobrze opisuje krzywe doświadczalne. Podobne wyniki
uzyskano dla pozostałych stężeń kwasu.
Z równania (wzór 1.) wyznaczono parametry reologiczne modelu τy i ηp oraz n i m dla kwasu hialuronowego
a następnie wykreślono wykres zależności tych parametrów
od stężenia badanej cieczy [18, 19] (Ryc. 4.).
Wyznaczona wartość granicy płynięcia dla kwasu
hialuronowego wynosiła 0, co oznacza, że w tym zakre-
sie stężeń badana ciecz nie posiada właściwości tiksotropowych. Układ charakteryzuje się niskim oporem na
działanie zewnętrznych sił mechanicznych.
Stwierdzono również, że wraz ze zwiększaniem się
stężenia kwasu w układzie wodnym maleje współczynnik n (wykładnik płynięcia), jak i współczynnik m (wykładnik konsystencji). Na tej podstawie można wysunąć
wniosek, że wraz ze wzrostem stężenia następuje wzrost
właściwości pseudoplastycznych układu. Można również
wnioskować o wpływie budowy chemicznej na właściwości reologiczne roztworów. Zmiany wielkości makrocząsteczek spowodowane zmianami stopnia polimeryzacji i długości łańcuchów wywierają silny wpływ na te
właściwości związków wielkocząsteczkowych, które zależą
od wielkości masy cząsteczkowej [19].
Rycina 3. Zależność naprężenia ścinającego od szybkości ścinania dla kwasu hialuronowego, krzywe modelowe.
Figure 3. Shear stress versus shear rate for hyaluronic acid, model curves.
Rycina 4. Zależność parametrów reologicznych wyznaczonych z modelu Szulmana od stężenia kwasu hialuronowego.
Figure 4. Rheological parameters from Szulman model versus concentration of the hyaluronic acid.
Reologiczna analiza fizycznych właściwości kwasu hialuronowego
Wykazano również wzrost wartości lepkości plastycznej ze
wzrostem stężenia kwasu. Parametr ten określa się również
jako współczynnik nachylenia krzywej płynięcia.
Wnioski
1. Analizowane wodne roztwory kwasu hialuronowego przy wyższych szybkościach ścinania wykazują właściwości nienewtonowskie, pseudoplastyczne, posiadają charakter cieczy rozrzedzonych
ścinaniem.
2. Stosując matematyczne modele reologiczne uzyskano dobre dopasowanie krzywych doświadczalnych
do modelowych. Metoda wyznaczania wartości
funkcji celu z solvera oraz algorytmów genetycznych jest metodą dokładną, co umożliwia ich zastosowanie w analizie porównawczej wielu modeli reologicznych z określonymi parametrami.
3. Wyznaczenie parametrów reologicznych z modeli
pozwala na ścisłą charakterystykę fizykochemiczną
analizowanych układów, jak również przewidywanie właściwości fizycznych cieczy.
4. Badanie właściwości reologicznych kwasu hialuronowego za pomocą matematycznych modeli stwarza możliwość jego kompleksowej charakterystyki,
jak i również charakterystyki płynu synowialnego,
co z kolei jest ważnym czynnikiem w prognozowaniu procesów chorobowych.
Piśmiennictwo
1. Górecki M., Zalewska A.: Reometryczna analiza farmaceutycznych układów rozproszonych. Farm. Pol., 2000,
56, 748.
2. Górecki M., Zalewska A.: Reologia farmaceutyczna w analizowaniu układów nienewtonowskich. Farm. Pol., 2001,
57, 417.
3. Remmelgas J., Leal L.G., Orr N.V., Sridhar T.: Viscous
and elastic stresses in extensional rheometry. J. NonNewtonian Fluid Mech., 1998, 76, 111.
4. Syang-Peng Rwei, Saint-Wei Chen, Ching-Feng Mao,
Hsu-Wei Fang: Viscoelasticity and wear ability of hyaluronate solutions. Biochem. Eng. Journal, 2008, 40, 211217.
5. Krause W.E., Bellomo E.G., Colby R.H.: Rheology of sodium hyaluronate under physiological conditions. Biomacromolecules, 2001, 2, 65-69.
411
6. Scott D., Coleman P.J., Mason R.M. and Levick J.R.:
Concentration dependence of interstitial flow buffering
by hyaluronan in synovial joints. Microvasc. Res., 2000,
59, 345-353.
7. Lapcik L. Jr., Schurz J.: Photochemical degradation of
hyaluronic acid by singlet oxygen. Coll. Polym. Sci.,
1991, 269, 633-635.
8. Rinaudo Marguerite, Rozand Yves, Mathieu Pierre, Conrozier Thierry: Role of different pre-treatments on composition and rheology of synovial fluids. Polymers, 2009,
1, 16-34.
9. Barbara M. Praest, Helmut Greiling, Rudiger Kock: Assay of synovial fluid parameters: hyaluronan concentration as a potential marker for joint diseases. Clin. Chim.
Acta, 1997,266, 117-128.
10. Byars J.A., Binnington R.D., Boger D.V.: Entry flow and
constitutive modelling of fluid S1. J. Non-Newtonian
Fluid Mech., 1997, 72, 219.
11. Górecki M., Zalewska A.: Rheometric analysis of physical stability of O/W type emulsion. Pol. J. Med. Phys.
Eng., 2001, 7, 317.
12. Passard J., Kouitat N., Perré P.: Unsteady flow in cone
and plate geometry: how computation can help rheometry. Eur. Phys. J. AP., 1998, 3, 321.
13. Zhu H., Kim Y.D., De Kee D.: Non-Newtonian fluids
with yield stress. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 2005,
129, 177.
14. Moukhtarova S.E., Krivoschepov A.F., Kim V.E.: Applicability of rheological models of flow to stearatestabilized emulsions. Coll. J., 2004, 66, 112.
15. Goldberg D.E.: Algorytmy genetyczne i ich zastosowania. WNT, W-wa, 1998.
16. Holland H.: Algorytmy genetyczne. Świat Nauki, 9/92.
17. Mendyk A., Jachowicz R.: Neutral network as a decision
support system in the development of pharmaceutical
formulation – focus on solid dispersion. Expert System
with Application, 2005, 28, 285.
18. Mitchell M.: An introduction to genetic algorithm, IT,
Press, MA, 1998.
19. Zalewska A., Górecki M.: Assessment of physical properties of macromoleclues used in pharmacy using genetic
algorithm. Int. J. App. Mech. Eng., 2005, 10, 165.
Adres do korespondencji:
e-mail: [email protected]
Tel.: 61 8546608