instrukcja do ćwiczenia nr 5

Ćwiczenie laboratoryjne nr 5 dla e-Rolnictwa (3 - skrypt).
Metody chromatograficzne – rozdział białka i jonów amonowych na kolumnie
wypełnionej żelem Sephadex G-25.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z podstawami teoretycznymi metod
chromatograficznych stosowanych bardzo często w laboratorium biochemicznym. Ponadto studenci
zapoznają się z frakcjonowaniem związków na zasadzie różnic w ich masach cząsteczkowych
metodą sączenia na żelu Sephadex.
Wiadomości wstępne
Chromatografia jako metoda rozdzielania składników mieszanin różnych substancji jest
bardzo szeroko stosowana w pracach biochemicznych. Rozdział chromatograficzny jest wynikiem
zróżnicowanego powinowactwa poszczególnych składników mieszaniny do fazy stacjonarnej i
ruchomej, w których ten proces zachodzi. Powinowactwo z kolei jest uzależnione od stopnia
adsorpcji, wymiany jonów i rozpuszczalności związków w określonych warunkach rozdziału oraz
masy cząsteczkowej związku. W praktyce w każdym procesie chromatograficznym współdziałają ze
sobą przynajmniej dwa spośród tych zjawisk. W zależności od przewagi czynników działających
różnicująco na rozdzielane substancje można wydzielić 4 zasadnicze metody chromatograficzne:
chromatografię adsorpcyjną, jonowymienną, podziałową i sita molekularnego.
Chromatografia adsorpcyjna. Jest to najstarsza metoda chromatograficzna. Opiera się ona na
zjawisku adsorpcji, czyli przechwytywaniu z roztworu cząsteczek różnych substancji i wiązania ich
za pomocą słabych oddziaływań fizykochemicznych występujących na powierzchni adsorbenta.
Powinowactwo rozdzielanych związków do adsorbenta jest funkcją ich budowy chemicznej,
charakteru adsorbenta i stosowanych rozpuszczalników.
Adsorbentem jest nierozpuszczalna w stosowanym rozpuszczalniku substancja, nie reagująca
z rozdzielanymi związkami, zazwyczaj uformowana w postaci kolumny w rurce szklanej lub
plastikowej. Na szczycie kolumny, zrównoważonej rozpuszczalnikiem, umieszcza się mieszaninę
związków rozpuszczonych we właściwym, zwykle niepolarnym rozpuszczalniku, i po wsiąknięciu
przemywa następnymi porcjami tego samego rozpuszczalnika. Ponieważ różne związki wykazują
różne powinowactwo do adsorbenta, w czasie przesuwania się roztworu po powierzchni jego cząstek
następuje rozdzielenie mieszaniny na poszczególne składniki. Ruchliwość chromatograficzna
związków jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa sorpcyjnego i dlatego substancje
słabo adsorbujące się (o mniejszym powinowactwie) przesuną się na większą odległość niż
substancje silnie adsorbowane (o większym powinowactwie). Przy rozdzielaniu substancji barwnych
jest to widoczne bezpośrednio. Można wówczas zawartość kolumny wypchnąć z rurki, pociąć na
warstwy odpowiadające poszczególnym związkom, wymyć odpowiednim rozpuszczalnikiem i
oznaczyć ilościowo. Można także, w miarę rozwijania kolumny, zbierać frakcje określonej objętości
wypływające z dolnego jej końca.
Jakość rozdziału zależy w dużym stopniu od równomiernego wypełnienia kolumny
adsorbentem. Stosowane adsorbenty dzieli się na 3 grupy zależnie od ich zdolności sorpcyjnej,
mianowicie na:
1) słabe – sacharoza, skrobia, celuloza, węglan sodowy,
2) średnie – węglan wapniowy, fosforan wapniowy, węglan magnezowy, tlenek magnezowy,
3) silne – krzemian magnezowy, tlenek glinowy, węgiel aktywowany.
Kolumnę można wypełnić adsorbentem bądź na sucho, przez wsypywanie małych porcji i
równomierne lekkie ubijanie, bądź na mokro, przez wlewanie zawiesiny adsorbenta w
rozpuszczalniku. Najczęściej stosowane są rozpuszczalniki niepolarne lub o niskiej polarności, takie
jak heksan, benzen, eter naftowy, cykloheksan, toluen, chloroform i różne alkohole.
1
Uwaga! Toluen i benzen ze względu na działanie rakotwórcze stosuje się z największą
ostrożnością.
Chromatografia adsorpcyjna ma zastosowanie przy rozdzielaniu licznych związków
niepolarnych, takich jak tłuszcze, sterydy, karotenowce, chlorofile. Rozdział oparty na zjawisku
adsorpcji towarzyszy także w pewnym stopniu innym metodom chromatograficznym.
Chromatografia jonowymienna. Jest to metoda stosowana do rozdzielania substancji o
charakterze jonowym i polega na wymianie jonów między związkami rozdzielanymi zawartymi w
mieszaninie i substancją wiążącą, czyli jonitem. Jako substancje wiążące stosowane są
nierozpuszczalne żywice wielkocząsteczkowe, zawierające liczne grupy dysocjujące. Główne
zastosowanie mają jonity syntetyczne, tzw. żywice, w których do wysoce spolimeryzowanych i
rozgałęzionych węglowodorów wbudowane są liczne grupy funkcyjne zdolne do dysocjacji. Jako
jonity mogą być stosowane między innymi pochodne celulozy i sefadeksu.
W zależności od rodzaju zdolnych do dysocjacji grup funkcyjnych jonity dzielimy na
kationity i anionity. Kationity dysocjują na ruchliwy kation i związany z nierozpuszczalną siecią
anion, anionity zaś odwrotnie, na ruchliwy anion i związany z siecią kation. Oddysocjowane kationy
(najczęściej H+ i Na+) i aniony (najczęściej OH–) mogą być wymieniane na inne jony pochodzące z
roztworu.
W wyniku działania sił elektrostatycznych między jonami jonitu i jonami rozdzielanych
związków następują reakcje wymiany. Zależnie od wypadkowego ładunku każdego z tych związków
ich powiązanie z jonitem wykazuje różny stopień trwałości i dlatego mogą one być wymywane
selektywnie z kolumny za pomocą roztworów o odpowiedniej sile jonowej. Na tej podstawie
następuje rozfrakcjonowanie składników mieszaniny.
Chromatografia sita molekularnego. Rozdział mieszaniny tą metodą opiera się na różnej
szybkości migracji poszczególnych związków przez złoże utworzone z granulek żelu o porach
określonej wielkości. Szybkość ta jest uzależniona od wielkości cząstek rozdzielanych związków.
Najbardziej
rozpowszechnionym
preparatem do rozdziału tą metodą jest żel
dekstranowy – Sephadex firmy Pharmacia,
z którego po napęcznieniu formuje się
kolumnę w rurce szklanej. Żel ten
zbudowany jest z łańcuchów α-D-glukozy
połączonych między sobą mostkami
poprzecznymi z epichlorohydryny (Rys.
1). Od liczby tych mostków zależy
wielkość porów, a od niej z kolei zdolność
rozdzielcza żelu.
Rys. 1. Struktura Sephadexu.
Istnieją preparaty Sephadexu o różnej, ściśle określonej wielkości porów, dostosowane do
rozdziału cząsteczek różnej wielkości. Najważniejsze ich typy mają następującą charakterystykę
(Tab. 1):
2
typ
G-25
G-50
G-100
G-200
zdolność wiązania H2O
w g/g s.m. preparatu
2,5
5,0
10,0
20,0
Średni rozmiar „oczek”
sita (mesh)
2500
15000
65000
150000
Zdolność rozdzielcza
cząsteczek w Da
100-5000
500-10000
1000-100000
1000-200000
Tabela 1. Wybrane cechy rożnych typów żeli Sephadex dostępnych w sprzedaży.
W miarę rozdzielania na kolumnie z sefadeksu mieszaniny złożonej np. z trzech związków,
różniących się masą cząsteczkową, będzie zachodził następujący proces. Duże cząsteczki (większe
od wielkości porów) nie są w stanie wnikać w pory granulek żelu ze względu na swój rozmiar,
wobec czego będą szybko przemieszczać się przez wolne przestrzenie między granulkami i
wędrować w dół kolumny wraz z czołem rozpuszczalnika (Rys. 2). Prędkość przemieszczania się
wzdłuż żelu cząsteczek mniejszych zdolnych do dyfundowania przez pory jest niejednakowa i
odwrotnie proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej, tzn. większe cząsteczki wędrują szybciej niż
mniejsze. Im mniejsza jest więc cząsteczka, tym droga jej migracji przez złoże kolumny jest dłuższa i
dłuższy czas wypływu.
Rys 2. Przepływ przez kolumnę wypełnioną sefadeksem związków nisko- i wysokocząsteczkowych.
Procesowi sączenia na sicie utworzonym z porowatych granulek żelu towarzyszą często
zjawiska adsorpcji i podziału.
Żel Sephadex stosowany jest do:
– rozdzielania mieszanin na kolumnie,
– odsalania w roztworze substancji wysokocząsteczkowych,
– wyznaczania mas cząsteczkowych,
– zagęszczania roztworów substancji wysokocząsteczkowych.
Żel Sephadex stosuje się najczęściej do oznaczania orientacyjnej masy cząsteczkowej białek.
Można także mierzyć objętość roztworu wypływającego z kolumny od momentu startu do wpływu
nieznanego białka i porównując go z objętością roztworu, przy której wypływa białko o znanej masie
cząsteczkowej, wnioskować o masie cząsteczkowej białka nieznanego.
Przy zagęszczaniu roztworów substancji wysokocząsteczkowej wykorzystuje się zdolność
pęcznienia żelu. Dobierając odpowiedni typ preparatu, można doprowadzić do pochłaniania przez żel
wody i związków o niskiej masie cząsteczkowej, a pozostawiania na zewnątrz żelu składnika
zagęszczonego. Zagęszczanie prowadzi się przez wsypanie określonej ilości suchego sefadeksu do
zlewki z roztworem; po jego napęcznieniu oddziela się żel przez wirowanie lub filtrowanie.
Chromatografia podziałowa. W metodzie tej rozdział mieszaniny na poszczególne składniki
jest oparty na różnej rozpuszczalności rozdzielanych związków w dwóch nie mieszających się fazach
ciekłych: fazie stacjonarnej i fazie ruchomej. Prędkość migracji poszczególnych związków jest
3
uzależniona od stopnia ich rozpuszczalności w obu tych fazach. Stosunek stężenia rozdzielanej
substancji w fazie stacjonarnej (A1) do jej stężenia w fazie ruchomej (A2) nosi nazwę współczynnika
podziału (α):
α=
A1
A2
Różne związki charakteryzują się różnymi wartościami współczynnika α i to umożliwia ich
rozdział chromatograficzny.
Najszerzej stosowanymi typami tej metody są chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa.
W chromatografii bibułowej rolę nośnika pełni bibuła chromatograficzna, która wraz z
naniesioną mieszaniną związków zostaje zanurzona w układzie rozpuszczalników (faza rozwijająca).
Nanosi się na nią punktowo mieszaninę związków i koniec najbliższy, ale poniżej punktu naniesienia
zanurza się w układzie rozpuszczalników. Układ taki składa się z rozpuszczalników o różnej
polarności, np. butanol – woda. Zachodzi wówczas następujący proces: nośnik, czyli celuloza,
tworzy z fazą polarną kompleks wskutek właściwości hydrofilowych bibuły, wobec czego faza ta
zostaje unieruchomiona i stąd nosi nazwę fazy stacjonarnej. Faza ta jest sukcesywnie przemywana
przez przesuwającą się po niej ruchomą fazę niepolarną, którą w tym wypadku będzie butanol. W
trakcie tej migracji naniesiona na bibułę mieszanina ulega podziałowi ze względu na różną
rozpuszczalność poszczególnych składników w obydwóch fazach. Droga przemieszczenia tych
składników od punktu naniesienia w trakcie tzw. rozwijania chromatogramu będzie więc różna. Na
przykład, związki rozpuszczające się lepiej w rozpuszczalnikach polarnych (fazie stacjonarnej)
przesuwają się na mniejszą odległość niż związki lepiej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach o
mniejszej polarności (fazie ruchomej).
Prędkość wędrówki poszczególnych składników w określonych warunkach wyraża się tzw.
współczynnikiem przesunięcia (Rf):
Rf =
przesunięcie badanej substancji
przesunięcie czoła rozpuszczalnika
Wartość Rf badanej substancji zależy przede wszystkim od współczynnika podziału (α), a
więc od rodzaju fazy rozwijającej, oraz takich warunków, jak: wysycenie kamery parami
rozpuszczalników, temperatura otoczenia, rodzaj bibuły i czystość odczynników.
W chromatografii bibułowej można stosować technikę wstępującą, zstępującą i krążkową. W
technice wstępującej układ rozpuszczalników podsiąka od dołu arkusza bibuły ku górze, w technice
zstępującej spływa pionowo z góry w dół, a w technice krążkowej podsiąka za pomocą "knota" od
środka krążka bibuły umieszczonego poziomo i rozprzestrzenia się promieniście.
W celu zlokalizowania i zidentyfikowania rozdzielonych związków chromatogram wywołuje
się spryskując go po wysuszeniu roztworem odpowiedniego odczynnika dającego z tymi związkami
reakcję barwną. Jeżeli rozdzielone związki fluoryzują lub pochłaniają światło ultrafioletowe, to
można je łatwo zlokalizować oglądając chromatogram w świetle ultrafioletowym o odpowiedniej
długości fali.
Ze względu na znaczne uzależnienie wartości Rf od warunków rozdziału przy identyfikacji
rozdzielonych związków należy raczej posługiwać się wzorcami, tj. roztworami znanych związków o
bardzo wysokiej czystości, których występowanie w rozdzielanej mieszaninie jest spodziewane.
Związki takie nakrapla się na tym samym chromatogramie obok mieszaniny związków nieznanych,
rozwija w tych samych warunkach, a następnie po wywołaniu chromatogramu porównuje ich barwę i
współczynniki Rf.
4
W chromatografii cienkowarstwowej warstwę nośnika sporządza się na płytce szklanej lub
plastikowej. Jako nośnik stosuje się najczęściej celulozę, żel krzemionkowy, tlenek glinowy.
Warunki i zasady rozdziału oraz metody identyfikacji w technice cienkowarstwowej są takie same
jak w technice bibułowej, przy czym szybkość rozdziału jest tu znacznie większa i w pewnych
wypadkach może wynosić zaledwie kilkanaście minut. Stąd technika ta ma w pracach
laboratoryjnych coraz większe zastosowanie.
Rozdział białka i jonów amonowych na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-25.
Wprowadzenie
Chromatografia sita molekularnego znalazła zastosowanie m.in. przy odsalaniu substancji
wysokocząsteczkowych, np. białek, od związków niskocząsteczkowych. Proces ten zastępuje
długotrwałą i często kłopotliwą dializę, podczas której składniki niskocząsteczkowe przenikają przez
błonę półprzepuszczalną.
Odsalanie przeprowadza się na kolumnie sporządzonej z żelu Sephadex G-25. Rozdział taki
można przyrównać do chromatografii podziałowej, przyjmując, że na objętość całkowitą żelu w
kolumnie Vc przypada objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem Vo, objętość rozpuszczalnika
związanego z żelem – Vi i objętość samego żelu – Vg:
Vc = Vo + Vi + Vg
Rozpuszczalnik nie związany z żelem można więc traktować jako fazę ruchomą, a związany z
żelem – jako fazę stacjonarną. Objętość rozpuszczalnika nie związanego z żelem Vo wyznacza się
najczęściej stosując błękit dekstranowy – związek barwny o wysokiej masie cząsteczkowej,
wędrujący w kolumnie z czołem rozpuszczalnika.
W wypadku sączenia molekularnego fazę ruchomą i stacjonarną stanowi zwykle ten sam
roztwór. Przy określonej szybkości przepływu rozpuszczalnika przez kolumnę substancje przesuwają
się tym wolniej, im łatwiej wnikają do wnętrza żelu, a więc przy podobnej rozpuszczalności
rozdzielanych składników w cieczy elucyjnej – im mniejszą mają masę cząsteczkową.
Przy zastosowaniu kolumny z żelu Sephadex G-25 do odsalania białka od siarczanu
amonowego jako rozpuszczalnik używana jest woda. Stanowi ona zarówno fazę stacjonarną, jak i
ruchomą. W takich warunkach duże cząsteczki białka, niezdolne do wnikania do wnętrza żelu,
wędrują z czołem rozpuszczalnika. Pojawienie się białka w eluacie (czyli objętość elucyjna Ve)
odpowiada równocześnie objętości zerowej kolumny (Vo)
Ve białka = Vo
Składniki soli natomiast wnikają bez trudu do rozpuszczalnika wypełniającego pory
sefadeksu i dlatego wędrują znacznie wolniej. Ich objętość elucyjna będzie więc sumą objętości
rozpuszczalnika nie związanego z żelem (Vo) i związanego z żelem (Vi).
Ve soli = Vo + Vi
Przebieg procesu odsalania kontrolowany jest przez oznaczanie rozdzielanych składników w
eluacie z kolumny.
Do wykrywania białka w eluacie stosowana jest metoda Lowry’ego. W metodzie tej
wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność
aminokwasów aromatycznych. Metoda ta składa się z 2 etapów, w pierwszym zachodzi reakcja
biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i jony miedziowe w
5
środowisku zasadowym). W drugim etapie metody reakcja biuretowa jest wzmocniona reakcją z
odczynnikiem Folina-Ciocalteu, w której kwasy: fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulegają
redukcji do odpowiednich tlenków z udziałem głównie tyrozyny i tryptofanu. Stężenie barwnego
(fioletowego) kompleksu można mierzyć w zakresie widma widzialnego długości 600–750 nm.
Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się z krzywej
wzorcowej.
Jony amonowe w eluacie wykrywane są za pomocą odczynnika Nesslera (silnie alkaliczny
roztwór jodku rtęciowego w jodku potasowym), który daje barwny kompleks o natężeniu barwy
proporcjonalnym do stężenia NH4+ w badanej próbie. Tworzenie się barwnego kompleksu
przedstawia reakcja:
NH4OH + 2(KI)2 · HgI2 + 3KOH → NHg2I + 7KI + 4H2O
barwny
kompleks
Odczynniki:
1. Sephadex G-25 drobnoziarnisty (fine).
2. Odczynnik Nesslera.
3. Odczynnik miedziowy (patrz str. 20).
4. Odczynnik Folina (wykonanie patrz str. 131).
5. 2,5-proc. roztwór białka w 5-proc. siarczanie amonowym.
Wykonanie
Ćwiczenie wykonuje się w zespołach 2-osobowych. Studenci oddzielają białko od soli
amonowej na kolumnie z Sephadeksem G-25, ponadto oznaczają zawartość białka w roztworze
wyjściowym nanoszonym na kolumnę oraz w eluacie, a także wykrywają jony amonowe.
1. Sporządzanie kolumny. Kolumnę formuje się z uprzednio napęczniałego wodą żelu
Sephadex G-25 (1). Rurę chromatograficzną o wymiarach dostosowanych do rodzaju rozdzielanej
mieszaniny (długość) i ilości substancji (średnica) zawierającą przy wylocie zwitek z waty szklanej
umocować pionowo w statywie i napełnić jednorazowo żelem do wysokości ok. 20 cm. Na
powierzchni żelu ułożyć delikatnie krążek z bibuły filtracyjnej w celu zabezpieczenia kolumny przed
uszkodzeniem. Następnie otworzyć kran, aby płyn wyciekał z szybkością 15–20 kropli na minutę i
przemywać kolumnę 2–3-krotną objętością wody dejonizowanej.
2. Rozdział na kolumnie (studenci wykonują parami). Wyskalować 20 probówek na 1 ml i
jedną probówkę na 5 ml. Z przygotowanej kolumny wypełnionej Sephadexem G-25 zdjąć zacisk z
końcówki i odsączyć wodę znad żelu. Gdy warstwa H2O nad żelem będzie wynosiła ok. 1 mm
zakręcić zacisk kolumny, nanieść ostrożnie pipetą (aby nie naruszyć żelu) 2 ml roztworu białkowego
(5) i pod wylot kolumny podstawić probówkę wyskalowaną na 5 ml, po czym odkręcić zacisk. Po
prawie całkowitym wniknięciu naniesionego roztworu w żel również ostrożnie nanieść na kolumnę 1
ml wody w celu wmycia białka i soli do wnętrza żelu. Po wniknięciu i tej porcji czynność powtórzyć
jeszcze raz. Następnie kolumnę nad żelem napełnić ostrożnie wodą i utrzymywać jej objętość na
względnie stałym poziomie przez cały czas prowadzenia rozdziału. Po zebraniu pierwszych 5 ml
podstawić kolejne wyskalowane na 1 ml probówki, zbierając do nich następne frakcje po 1 ml. W
sumie zebrać 20 frakcji, po czym zamknąć wylot kolumny za pomocą ściskacza.
3. Oznaczanie zawartości białka w próbie wyjściowej i frakcjach wycieku z kolumny. W celu
oznaczenia zawartości białka w roztworze wyjściowym należy przenieść dokładnie 2 ml tego
roztworu do kolby miarowej na 50 ml, kolbę dopełnić wodą do kreski i dobrze wymieszać. Do 2
probówek pobrać po 1 ml roztworu, do 3 probówki dodać 1 ml H2O (próba materiałowa), do
wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego (3), wymieszać i po upływie 10 min
dodać, intensywnie wstrząsając probówkę, po 0,5 ml odczynnika Folina (4). Po 30 min mierzyć
intensywność zabarwienia w kolorymetrze przy długości fali 670 nm wobec próby materiałowej.
6
Uzyskaną wartość absorbancji (A) przeliczyć na µg białka, wykorzystując w tym celu krzywą
wzorcową (ew. własną, wykonaną w ramach kursu).
W celu oznaczenia zawartości białka w kolejnych frakcjach wycieku z kolumny należy
pobrać pipetą po 0,1 ml z frakcji od 1 do 10, uzupełnić wodą do 1 ml i postępować dalej jak podano
przy oznaczeniu białka w próbie wyjściowej. Do wyzerowania fotometru równolegle trzeba
przygotować próbę materiałową (z 1 ml wody).
4. Wykrywanie jonu amonowego. Do czystych probówek pobrać kolejno po 0,1 ml roztworu z
frakcji od 6 do 18, do każdej dodać po 4,4 ml wody dejonizowanej i po 0,5 ml odczynnika Nesslera
(2); całość dobrze wymieszać i obserwować intensywność wytworzonego pomarańczowego
zabarwienia.
Opracowanie wyników
W sprawozdaniu należy podać wyniki pomiarów stężenia białka w roztworze wyjściowym i
w eluacie, obliczyć procent odzyskanego białka w stosunku do naniesionego na kolumnę. Ponadto
wskazać numery frakcji, w których pojawia się jon NH+4 , osiąga maksimum i zanika, oraz obliczyć
objętość zerową kolumny na podstawie objętości potrzebnej do wyeluowania maksymalnego stężenia
białka.
Pytania
1. Na jakich zasadach opiera się rozdział substancji w metodach chromatografii: adsorpcyjnej,
jonowymiennej i podziałowej?
2. Co to są jonity? Jaki jest mechanizm działania kationitu, a jaki anionitu?
3. Którą z metod chromatograficznych można zastosować do rozdziału mieszaniny
aminokwasów? Uzasadnić odpowiedź.
4. Jakie techniki stosuje się w chromatografii podziałowej? Na czym one polegają?
5. Co to jest współczynnik Rf? Od czego zależy jego zawartość?
6. Co to jest współczynnik podziału α?
7. Na jakiej zasadzie opiera się rozdział substancji metodą chromatografii sita
molekularnego?
8. Jakie zastosowania w biochemii może mieć Sephadex?
9. Jak zbudowany jest żel Sephadex?
10. Od czego zależy zdolność rozdzielcza żelu Sephadex?
11. W jaki sposób można się przekonać o skutkach rozdziału mieszaniny na kolumnie z
sefadeksu?
12. W jakiej kolejności wypływają z kolumny wypełnionej żelem Sephadex G-25 i G-100 jon
amonowy, peptyd protamina (2–3 kDa) i pepsyna (35 kDa)?
13. Na jakiej zasadzie oparty jest proces odsalania białek?
14. Wymień dwie właściwości odróżniające Sephadex G-25 od G-200.
15. Opisać zasady metod oznaczania stężenia rozdzielanych związków we frakcjach
zbieranych po kolumnie.
7